L-色氨酸生产菌的筛选
L—色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的研究
L—色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的研究
陈宁;孙涛
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】1997(023)005
【摘要】以谷氨酸棒杆菌ＡＳ１５４２为发菌株，经过硫酸二乙酯诱变和紫外原
生质体诱变，定向选育出一株稳定的色氨酸生产菌Ｔ１１－６，该菌株具有苯丙氨酸，酪氨酸双重营养缺陷及对氟苯丙氧酸，５－甲基色氨酸，６－氟色氨酸三种结构类似物抗性遗传标记，对Ｔ１１－６的发酵条件进行了研究，引进均匀设计理论，以微机为辅助手段，确定出以葡萄糖为原料直接发酵生产色氨酸的优化配比，在最佳下，摇瓶产酸平均达１０．０１ｇ／Ｌ。
【总页数】6页(P10-15)
【作者】陈宁;孙涛
【作者单位】天津轻工业学院食品工程系;天津轻工业学院食品工程系
【正文语种】中文
【中图分类】TQ922.9
【相关文献】
1.酵母SOD高产菌的选育及发酵条件的研究 [J], 周建琴
2.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵条件研究 [J], 杨明琰;郭爱莲;沈俭;张晓琦;黄继红
3.类细菌素高产菌YCF10的诱变选育及发酵条件的研究 [J], 常峰;朱何东;梁波;罗
俊成;胡承;王忠彦
4.L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究 [J], 王健;陈宁;谭青乔;张克旭
5.磺胺胍抗性筛选法选育L-色氨酸高产菌株及其发酵条件的优化 [J], 李阳;刘峰;卢龙娣
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大肠杆菌发酵生产L-色氨酸工艺简析
大肠杆菌发酵生产L-色氨酸工艺简析廖韦红;褚宏;纪衍英【摘要】本文对L-色氨酸进行了简要概述,指出利用大肠杆菌工程菌直接发酵生产L-色氨酸为国内主流方法,并对其成熟的发酵工艺控制、提取工艺进行了简析,并指出部分可进一步优化的工艺点。
其中发酵工艺简析包括菌种培养基增加一定溶度抗生素和控制发酵温度来控制质粒稳定性;分析物料作用并提出优化后的种子、发酵培养基组成;菌种无需控制溶氧,而发酵则用溶氧反馈补料;控制乙酸和氨氮浓度、顺序升温缩短周期降低抑制性副产物作用。
分离提取工艺简析包括硫酸酸化p H2-3,陶瓷膜过滤并控制滤液平均单位为14000-18000u/ml,阳离子树脂纯化,醋酸调pH5.89,0.5%活性炭60℃脱色20-30min,蒸发浓缩结晶,纯化水洗涤整条工艺路线。
【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)004【总页数】2页(P11-12)【关键词】L-色氨酸;大肠杆菌;发酵生产;提取;工艺【作者】廖韦红;褚宏;纪衍英【作者单位】[1]山东鲁抗生物制造有限公司，山东邹城273517;[2]山东鲁抗医药股份有限公司，山东济宁272000;[3]山东鲁抗立科有限公司，山东济宁272000【正文语种】中文【中图分类】TQ92L-色氨酸，1825年首次被发现，是第二必需氨基酸，广泛应用于各行业。
化学名为α-氨基-β-吲哚丙酸，白色或微黄色片状晶体或粉末，溶于水，在稀酸或稀碱中较稳定。
在有NaOH、CuSO4存在下加热会分解产生大量吲哚。
其生产方法最早是化学合成法和蛋白质水解法，在上世纪90年代就被酶促转化法所替代。
又因酶促反应法底物价格高，转化率低，很快被微生物发酵法替代，有添加前体发酵和直接发酵两种形式。
前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。
又随着重组DNA技术在L-色氨酸生产菌株的筛选中的可靠应用，使直接发酵法更具优势，成为目前的主流工业方法。
L-色氨酸生产菌株有谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，枯草杆菌，重组大肠杆菌。
L-精氨酸高产菌红曲霉的筛选及发酵初步研究
，
但 菌株 产酸 水平 和遗 传 稳定 性 仍 与 日本 、 国及 美
一
精氨 酸浓度 为横 坐 标 ， 光 度 为纵 坐标 绘 制 标 准 吸
些 欧州 国家存 在很 大差距 ， 产量大 约 为 ３ ／ 其 ０ｇ
，
曲线 。其结 果如 图 １ 示 ； 菌体 生物量 测定 ： 所 ② 发
酵完 成后 ， 发 酵 液 转 移 至 ５ 将 ０ｍＬ离 心 管 ， ０ ７０ ０ ｒｒ ｎ离心 １ ｉ ， ／ｉ ａ ０ｍ ｎ 分离 并 收集 发 酵 液 和 菌丝 体 ，
关 键词 红 曲 霉 ；． 氨 酸 ； 态发 酵 ； 化 Ｌ精 液 优 Ｑ １ ８５ 文献标识码 Ｂ 文章编号 １０ ７ ２ （ ０ ２ ｏ ０ ９ ０ ０ ５— ０ １ ２ ｌ ） ４— ０ ５— ５
中 图分 类 号
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｆ Ｈ ｉ ｈ Ｌ— ｇ ｎ ｎｅ Ｐｒ ｄ ｔｎｇ Ｓ ｒ ｉ ｆＭ ｏ ａ ｃ ｓ ｓ ｐ． ａ ｄ ｃ ｅ ｎ ｎｇ ｏ ｇ Ａｒ ｉ ｉ ｏ ｕｃ ｉ ｔ ａ ｎ ｏ ｎ ｓ ｕ ｐ ｎ
发酵液中L-色氨酸的提取纯化实验指导书
发酵液中L-色氨酸的提取纯化实验指导书一、实验目的1.了解氨基酸的一般提取纯化工艺；2.掌握离子交换过程的反应机理。
二、概述和原理分离纯化是氨基酸工业生产中的一个重要组成部分，它在投资及产品中的费用都占有很大比例。
因此，研究分离纯化技术，降低其成本，对氨基酸工业的发展是非常重要的。
发酵液是极其复杂的多相体系，含有微生物细胞、代谢产物、未耗用的培养基等。
氨基酸的提取纯化，主要是应用它的物理化学性质，如两性电解质的特性，溶解度，分子大小，分配系数及与吸附剂吸附特性等，达到把发酵液氨基酸提取出来的目的。
一般的氨基酸分离纯化步骤可简分为：浓缩其中离子交换法具有设备投资少、纯化效果好、工艺简单、污染小、节能的优点，常用于工业生产中氨基酸的提取。
其原理主要是应用氨基酸的两性电解质特性：在酸性溶液中，氨基酸以阳离子状态存在，因而能被阳离子交换树脂交换吸附；在碱性溶液中，氨基酸以阴离子状态存在，因而能被阴离子交换树脂交换吸附。
根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异，通过调节氨基酸发酵液的pH值，使不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，再通过选择合适的离子交换树脂就能分离纯化各种氨基酸。
三、实验试剂及仪器1.试剂L-色氨酸发酵液(由实验一提供)；浓硫酸(AR 95.5%)；盐酸；氢氧化钠；氨水；冰醋酸；001×7型阳离子交换树脂。
2.仪器离子交换柱，离心机，控温磁力搅拌器，旋转蒸发仪，蠕动泵、真空干燥箱。
四、实验操作步骤1.树脂预处理及装柱先用蒸馏水冲洗001×7型阳离子交换树脂除去杂质，然后用2 mol/L的HCl和NaOH 溶液反复浸泡3次后，再用2 mol/L的HCl转成H+型，最后用去离子水洗至中性备用；离子交换柱用去离子水冲洗干净后，在柱中先装入半柱水，然后将树脂和水一起倒入柱中，让树脂自然沉降。
装柱时应注意柱中的水不能低于树脂界面，否则，树脂间形成气泡，影响交换效率。
L色氨酸产生菌选育及其发酵动力学研究
L色氨酸产生菌选育及其发酵动力学研究L-色氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。
因此，对于L-色氨酸产生菌的选育及其发酵动力学的研究具有重要意义。
本文将从选育方法、发酵动力学两个方面进行讨论。
一、L-色氨酸产生菌的选育（一）菌种的筛选：通过实验室条件下对于多个菌株进行观察和分析，选出L-色氨酸产生能力较强的菌株。
可以通过体外培养试验，通过观察L-色氨酸的产量和菌落形态，筛选出优质菌株。
（二）菌种的改良：通过自然诱变、化学诱变以及基因工程手段，对菌株进行改良。
自然诱变是指在菌株之间进行交配或者菌株自身发生突变。
化学诱变可以通过化学物质的处理来诱发突变。
基因工程手段可以通过引入外源基因来改良菌株，提高L-色氨酸产生能力。
（一）菌种的培养基优化：通过改良培养基成分，使其更加适合L-色氨酸产生菌的生长和代谢。
可以通过改变碳源、氮源、微量元素等成分的比例来优化培养基。
（二）发酵条件的优化：对于发酵的环境条件进行优化，包括温度、pH值、发酵时间、罐内气体的气体成分等。
通过对这些因素的调整，可以提高L-色氨酸的产量和产率。
（三）代谢途径的调控：通过调控菌株的代谢途径，进一步提高L-色氨酸的产生。
可以通过控制关键酶的活性，调节代谢途径的通量，提高L-色氨酸的合成速率。
（四）反应动力学模型的建立：通过对发酵过程中的各种参数进行测定和分析，建立L-色氨酸的反应动力学模型。
可以通过模型的分析，预测和优化发酵过程。
总结起来，选育L-色氨酸产生菌主要涉及菌株的筛选和改良；发酵动力学研究主要包括培养基优化、发酵条件优化、代谢途径调控和动力学模型的建立。
通过这些研究，可以提高L-色氨酸的产量和产率，为L-色氨酸的生产提供技术支持和理论指导。
L-色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化的开题报告
L-色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化的开题报告一、选题背景及意义色氨酸是一种重要的氨基酸，在医学、食品工业、化学工业等领域中有着广泛的应用。
目前，大多数色氨酸的生产是通过化学合成实现的，由于其分子结构的复杂性，合成成本较高，而且合成的产物容易受到污染和环境污染问题。
因此，寻求一种高效、环保的生物合成方法，就显得尤为重要。
色氨酸合成的最终目的是要获得高纯度的L-色氨酸，因此需要使用高产菌株。
此外，发酵条件的优化也对提高色氨酸产量至关重要。
因此，本文旨在选育L-色氨酸高产菌株，并通过优化发酵条件，提高L-色氨酸的产量，为生产高纯度的L-色氨酸提供一种可行的方法。
二、选题内容及方法1. 选育L-色氨酸高产菌株通过筛选不同的菌株，选育出一种L-色氨酸高产的菌株。
初始阶段将使用不同的培养基，包括Luria-Bertani（LB）培养基、M9培养基、中等选择性培养基等，并使用不同浓度和比率的糖类和氮源来寻求最适合L-色氨酸合成的培养条件和培养细节，从而达到高产菌株的选育目的。
2. 产酸菌对色氨酸产酸的影响在L-色氨酸生产过程中，一些产酸菌可能会对色氨酸的合成产生负面影响。
因此，将研究产酸菌对L-色氨酸合成的影响，也会探索针对这些产酸菌的处理策略。
3. 优化发酵条件通过改变发酵条件，例如气体供应、温度和pH，进一步提高L-色氨酸的产量。
将对不同的发酵条件进行研究，以了解每个变量对产量的影响，并将最优条件应用于大规模的产酸过程。
4. 产品分离和提纯通过膜分离、离子交换、逆渗透等技术，对发酵液进行处理并获得高纯度的L-色氨酸。
三、预期成果及意义通过本研究，有望选育出L-色氨酸高产菌株并优化发酵条件，从而实现高效低成本的生物制造L-色氨酸过程。
同时，研究发现的产酸菌和其他负面影响，可以指导未来合成L-色氨酸的研究和生产。
最终，高纯度的L-色氨酸将应用于医药、食品工业、化学工业等领域，推动相关领域的发展。
L-色氨酸高产菌种和工艺技术
L-色氨酸高产菌种和工艺技术L-色氨酸（L—Tryptophan）属于芳香族氨基酸，含氮13.72％，α-氨基氮6.86％。
L-色氨酸有三种光学异构体，L-色氨酸呈绢丝光泽、六角片状白色晶体，无臭，有甜味。
水中溶解度为1.14g/l(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。
微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
L-色氨酸具有重要的生理作用，在生物体内从L-色氨酸出发可合成激素、色素、生物碱、辅酶和多种生理活性物质。
在临床上主要用于医药，如氨基酸输液，抗闷剂，抗臭滤药，调节脑代谢等作用。
新近的研究报导，L-色氨酸在体内能借助的作用生成神经荷尔蒙的前体5-羟基色胺，从而促进睡眠和精神安定，维生素B6已被用作保健食品和安神药。
目前L-色氨酸的主要应用是作营养药剂，人工合成膳食，必需氨基酸片，及水解蛋白质的添加剂。
L-色氨酸与铁剂、维生素等合用可以提高抗贫血疗效，此外，还可用作消化溃疡组氨酸的佐药。
L-色氨酸在人和动物体内能转变为许多生理上重要的物质。
如可生成B族维生素之一菸酸。
如果L-色氨酸、菸酸不足，就会引起癞皮病。
国内生产的企业大约有：山东鲁抗、升华拜克与横店等，有一些企业没有获得生产许可证，对外委托加工，主要出口。
目前饲料级L-色氨酸成交价：400元/kg,利润比较可观。
CAS编号：73-22-3，分子式：C11H12N2O2，分子量：204.231．技术水平发酵单位40-50g/L发酵时间:32小时产品得率:70%产品质量:>98.0%(纯度)生产菌种:E.coli工程菌生产成本：80-90元/KG说明：1、主要原料为葡萄糖，原料易得，不需要吲哚，成本低廉；2发酵过程中需要补加葡萄糖和氨水。
2．工艺流程斜面--摇瓶--一级种子---二级种子---生产发酵---过滤----树脂吸附与解析----纳滤浓缩----脱色----喷雾干燥---成品。
L—丝氨酸产生菌的选育及发酵条件优化的研究
L—丝氨酸产生菌的选育及发酵条件优化的研究随着经济和科学技术的不断发展，极大地促进了社会发展，促进了我国农业和工业的发展。
特别是对工业化的发展产生较大影响，增加了对L-丝氨酸的需求量。
为了促进工业社会的可持续发展，发挥L-丝氨酸的最大效力。
文章主要就L-丝氨酸产生菌的选育及发酵条件优化进行分析和研究。
标签：L-丝氨酸；产生菌；选育发酵；条件优化；分析研究前言L-丝氨酸是一种化学物质，其自身存在不同化学元素，包括氨基元素和甘油酸等等元素整合而成，甘油酸元素是L-丝氨酸的主要元素，也是L-丝氨酸不可缺少的元素。
L-丝氨酸，其也被叫做生糖性的氨基酸，在当下社会中的食品领域和医药、农业、工业等领域广泛应用，具有较好的实际应用性。
1 L-丝氨酸阐述L-丝氨酸具有化学性质，其在当下我国的不同领域发挥着主要作用，保证在工业领域和食品领域，饲料的制作与化妆品的研究等等工作中发挥着不可替代的作用。
利用L-丝氨酸需要较多的财务支出，增加了生产的压力。
L-丝氨酸主要是由氨基和甘油酸等等物质构成，随着社会的各行各业的不断发展，不同领域对L-丝氨酸的需求不斷增加。
但是L-丝氨酸的价格较高，这是导致L-丝氨酸的使用率降低的主要原因。
因此，需要增加对于L-丝氨酸开发，增加对L-丝氨酸产生菌的选育及发酵条件的关注度，来营造良好的发酵环境。
L-丝氨酸的合成方法具有多样性的特点，包括利用蛋白质来进行水解的方法，利用蛋白质来进行酶法，利用以往的L-丝氨酸合成方法和化学方法结合的形式，来进行合成。
对于L-丝氨酸来说，其具有中间性，在对L-丝氨酸进行发酵作业时，需要利用间接的形式来进行发酵。
在L-丝氨酸的产生前期，在L-丝氨酸不同物质中增加发酵元素，来减低L-丝氨酸的财务支出力度，保证L-丝氨酸的实际应用价值。
2 选育和发酵条件优化的阐述2.1 L-丝氨酸产生菌选育L-丝氨酸产生菌选育主要包括以下几点内容。
其一，对浓度较高的甲醇性L-丝氨酸产生菌选育作业。
微生物发酵法生产L-色氨酸的研究进展
微生物发酵法生产L-色氨酸的研究进展闻亚红;刘杰;黄建民【摘要】Referring to the research reports on microbial fermentation production of tryptophan, this article reviews the biosynthetic pathway and metabolicregulationmechanismoftheL-tryptophan,focusesonthecurrentsituationofacidproducingbacteriaselection andfermentationoptimiza-tionofL- tryptophanusingrecombinantDNAtechnology,itmaygivesomehelptothestud yonL- tryptophan.%依据国内外利用微生物发酵法生产L-色氨酸的研究报道，本文系统归纳了L-色氨酸的理化性质、应用及其主要生产方法的研究进展，重点介绍了L-色氨酸高产菌株的选育与发酵优化的研究现状，为工业化生产提供一定依据。
【期刊名称】《科技风》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】2页(P10-11)【关键词】L- 色氨酸;微生物发酵法;工业化;最新进展【作者】闻亚红;刘杰;黄建民【作者单位】江苏江山制药有限公司，江苏靖江214500;江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500;江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500【正文语种】中文1 色氨酸的理化性质色氨酸又名氨基吲哚丙酸，分子式：C11H12N2O2，分子量：204.23，为白色或微黄色的叶片状结晶或粉末，无臭或微臭。
有L-型（左旋）、D-型（右旋）和DL-型（消旋）三种旋光异构体，其中L-型稍有苦味、DL-型和D-型味稍甜，能被人类和动物吸收利用的只有L-型。
在水中微溶，溶解度为1.14g（25℃），可溶于热吡啶、稀酸或稀碱，微溶于乙醇；若长时间光照则着色，迅速加热至210℃时发黄，289℃分解；与水共热时可产生少量吲哚，如与氢氧化钠、硫酸铜共存时加热，可产生大量吲哚；与酸在暗处加热较稳定，与其他氨基酸、糖类、醛类共存时极易分解。
诱变选育具有磺胺胍抗性的L-色氨酸产生菌的研究
ｈｇ ｌ ｐ ｏ ｕ ｉｇｍ ｔ ｔ Ａ ０ （ ｈ 一＋Ｔ ｒ ｉ ｙ ｒ ｃｎ ｕａ ５ ７ Ｐ ｅ ｈ ｄ ｎＧ ｙ 一十５ Ｔ ＋Ｓ ａ ｏ ｔ ｎ ｄ ｈ — ｙ ｔ ｂ ｎ ｙ ｌ ｒａｈ ｄ５ ３ ／ ，ｗ ｉ ａ Ｍ Ｇ ）ｗ ｓ ｂａ ｅ ．Ｔ ｅＬ ｔ ｐｏ ａ ｉ ｄ ｅ ｃ ｅ ． ５ ｇ Ｌ ｈｃ ｗ ｓ ｉ ｒ ｐ ｅ ｈ
作者简介 ： 钱建文（９ ６一） 男 ， １８ ， 云南 曲靖人 ， 士研究生 ， － ａ ：ｉｇｅｅ９ ＠ｙｈｏ ｃｎ．ｎ 硕 Ｅ ｍ ｉ ｑｎｇｇｌ０ ａｏ．ｏ ｃ ； ｌ 通讯作者 ： 刘
２６
峰， ， 男 汉族 ， 主要研究方向为工业微生物育种及发酵 ， — ｉ：Ｕ ９ ＠ １３ ｔｍ。 Ｅｍａ ｆ ９ ９ ６ ．ｏ ｌｊ
Ｋ ｅ ｗｏｒ ｙ ｄｓ： Ｌ—ｒ ｐ ｏ ａ ｔｙ ｔｐｈ ｎ；ＬＤ—ａ ｅ ｌｓ ｒ；ＵＶ ；ＥＭ Ｓ；ｓ ｆ ｎａ ｄｅ ｕｌ ｏ ｍｉ
Ｌ色氨酸 （ ｒ ｔ ｈｎ 化学 名称为 Ｏ 氨基一 一 哚 － Ｔｙ ｏ ａ ） ｐｐ ｔ 一 Ｂ吲 基丙酸 ， ８种必须氨基酸之一 ， 是 生物体本 身不能合成 Ｌ色氨酸 ， ． 需要 从食 物 中获 取。Ｌ色氨 酸对 人体及 动 ．
１６ １ 初筛 ． ．
将在磺 胺胍抗 性筛 选平 板上 长势 良好
的菌落挑出接种 于试管斜 面保藏 。然后 ， 把抗 性 突变
四硼 酸钠 ０ １ｍ ｇ Ｌ ｐ ． ／ ， Ｈ值 ７０～７ ２ １５ 灭 菌 ２ ． ． ，１ ％ ５
ｍｉ ｎ。
菌株接 种到三角瓶 中 ， ℃发酵培养 ７ 。 ３ ０ ２ｈ １６２ 复筛 将待复筛 的菌 株接 种于 含有 １ Ｌ发 ．． ５ｍ 酵培养 基的 ２ ０ｍ 摇 瓶 中， ５ Ｌ 培养 ７ 。每个 菌株做 ５ ２ｈ 个平行试验 ， 比色法测定 Ｌ色氨酸的量 。 一
赖氨酸产生菌的筛选与分离
赖氨酸产生菌筛选和分离学生姓名专业生物工程学院食品工程学院2012年 4 月4日赖氨酸产生菌的筛选与分离一、目的筛选出高产的优良菌株，以提高糖的转化率和发酵液中赖氨酸的累积浓度，缩短发酵时间，提高生产效率从而减少生产成本。
二、意义赖氨酸(Lysine)的化学名称为2，6一二氨基己酸，有L一型(左旋)、D一型(右旋)和DL型(消旋)三种旋光学异构体。
人类和动物可吸收利用的只有L-型。
L-型赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。
由于其不能在人体内由还原氨基化作用或转氨基作用生成，必须由食物中摄取，因此赖氨酸有“特殊必须氨基酸”之称。
此外，赖氨酸在食品、医药以及生物饲料方面也占有极其重要的地位。
近几年来，它的经济价值和社会效益日趋引起人们的重视，随着发酵科学的不断发展，提高赖氨酸发酵产酸收率的研究，成为迫切需要解决的问题之一。
三、国内外研究概况及现状L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。
后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS(Dutch State Mijinen)法和日本的东丽法，此法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。
1960年，日木首先采用微生物发酵法生产。
微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。
氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。
我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。
直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。
我国上海工业微生物研究所采用山芋淀粉为原料选育出的AU1 12菌种产酸率8％一10％。
L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究
L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究氨基酸维普资讯氨基酸和生物资源A n￣ is& Boi R suel2 0, 5 3: l 3 mi e o. d it eore 0 3 2 ( ) 4一4 c 41L一色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究王健，陈宁，谭青乔，张克旭(津科技大学食品科学与生物工程学院，天天津 30 2 ) 0 22摘要：以代谢控制发酵理论为指导， L对一色氨酸产生菌的定向选育、摇瓶发酵条件、0L发酵罐发酵条件进行了研究。
3 以谷氨酸棒杆菌一3 ( h‘+’为出发菌株，硫酸二乙醋 ( E )次诱变处理，向选育出一株 L一色氨酸产生菌 2Pe )经 D S多定 3进行了 3酵罐分 0L发 ' ' 3Pe r ￣(h‘+Tr Q y‘+5￣"一ll+5一F r r+S l I'。
以摇瓶分批发酵最优条件为基础，菌株G+CI )￣ I对批发酵试验，菌株发酵 6h产 L该 4,一色氨酸 7. gL。
2 ~ 8关t坷：一色氨酸； L谷氨酸棒杆菌；变育种；诱发酵中圈分类号 tQ 2 T 92文献标识码： A文章编号：06―87 (o3 0―0 4―0 10 36 20 )3 0 1 3近年来，着色氨酸在医药、品和饲料等方面随食应用的开拓，场需求量不断增加…。
全世界年总市需求量达 l'以上，实际产量仅有 l0 t右。
ot而 O0左远远不能满足市场需求n。
酶法和和微生物转化法产 lL一。
1SO, 0 01 t. e 0. g L~。
e O4‘ H2 0. g’ F. S 7 0 O1 L一， VBI 0 tg。
3 0￣ VH 0 t p 2 0￣g, H7.― 7. 0 2o1 2 3发酵培养基各成分质量浓度： ..葡萄糖 17g 2 L ( )S 4 2g L,h 0 1g L, 0.5g~,N 2 O ~ P e .5‘~ 4 1酸水平低已困扰研究工作者多年b,后有 O a u】先 smK rhsi 、 a u a yih ua ah 等H l K t m t R o i等根据代谢控 s a c制发酵原理对 L一色氨酸发酵进行了研究。
大肠杆菌发酵生产l-色氨酸的研究
大肠杆菌发酵生产l-色氨酸的研究
l-色氨酸是一种重要的有机化合物，具有大量应用价值，即可作为兽药制剂剂型的基础，也可做为磷脂酰肌醇单元来承载细胞激素，同时具有重要的生物有效性，可作为肌肉组织保护剂、抗骨质流失剂等。
为了解决医药工业需求的增长，有效开发生产l-色氨酸的技术方案是迫在眉睫的问题。
近年来，研究人员借助大肠杆菌发酵的方式对l-色氨酸的生产进行了探索。
其中，利用菌株工程技术向大肠杆菌中植入表达l-色氨酸的基因是实现大肠杆菌发酵生产l-色氨酸的关键技术。
另外，研究者们在工艺参数方面也做出了努力，如尝试各种发酵梯度、进步多步次发酵等，以期最大化发酵效率。
此外，加入多种培养液补充剂也非常有助于加速发酵过程，如糖和氨基酸等。
同时，根据电子隐形色谱的结果确定l-色氨酸的产出也是生产过程的关键。
因为一般来说，l-色氨酸产出低于其他相关产物，所以研究者们需要合理操作、改进发酵参数来提高l-色氨酸的产出率。
总之，大肠杆菌发酵生产l-色氨酸是充分考虑发酵参数、改进工艺方案以及利用现有技术，从而实现可持续、可控、高效的新型发酵技术。
只有把这些元素完美结合起来，才能使大肠杆菌发酵生产l-色氨酸的研究取得实效。
L-色氨酸的生产方法
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在 此浓 度下 菌 体 生 长 受 到 阻 害 采 用 上 述浓度 的 三 种 类 似 物 分 别 单 独 地 添 加 在 前 述 的 基 本 培 , 养 基 中 从能 生 长 的菌 落 中 分 离得 至 种 抗性 株 止 产 生 色 氨酸 的 客
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组 氮 酸 缺陷 型 变 异 株法 ( 美 国 专利 第 3 5 9 4 2 7 9 )
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氛 酸 抗 性 株法 ( 美 国 专 利舒 了0 5钱 号 )
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一
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在 三 角 瓶 中培 养
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色氨 酸 的 产 量 一 般
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L-色氨酸生产菌的筛选
作 者 姓 名 专 业 指导教师姓名 专业技术职务
李 军 生物工程 陈 静 副教授
主要内容
本课题的目的和意义 国内外的现状和展望 实验材料和方法 结果与分析 讨论
本课题的目的和意义
本课题利用细菌生物合成L-色氨酸代谢途径 的特点，设计了分离筛选产色氨酸菌株的细 菌选择性培养基，并通过初筛和复筛，从土 壤中筛选到几株产色氨酸的野生菌株，并通 过诱变，进一步提高产色氨酸水平，有望达 到工业化生产的要求.
1.3.2土样采集 参照土样采集标准方法，从麦田，树林， 草丛，臭水沟等处采集土样和水样。 1.3.3富集培养 取1g土样加入盛有10mL无菌水的试管 中，震荡摇匀后取5mL悬浮液加入盛有25 mL选择性培养基的三角瓶中，30℃、150 r/min培养3-5天后。 1.3.4 菌株的筛选 1.3.4.1菌株的初筛
0.204 0.05 0.37 0.08 0.396 0.1
OD600 色氨酸 (g/L)
0.014 0.04
0.8 0.2
1.564 0.4
0.5
色氨酸（g/L）
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 OD600 1 1.2 1.4 1.6
图1L-色氨酸标准曲线
由图1可知，L-色氨酸含量与OD值之间形成 一条密切的直线关系。经线性回归，得到回 归方程:Y=0.253X，测得复筛菌株D-02OD为 1.025，计算得色氨酸含量为0.26g/L。再经 摇瓶发酵72小时后色氨酸产量达到0.76g/L。 2.2色氨酸产生菌的诱变选育 通过紫外线的诱变，测定了紫外线的不同 照射时间对出发菌株的致死率的影响，结果 如图2所示。根据图所示结果，紫外线诱变处 理的最佳时间为60秒。
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图3 菌株D-02的革兰氏染色图
表3复筛分离菌株的生理生化性质
性质 硝酸盐还原 脲酶 淀粉水解 胨化石蕊 葡萄糖利用 蔗糖利用 木糖利用 乳糖利用 果糖利用 阿拉伯糖利用 鼠李糖利用 淀粉利用 甘露醇利用 山梨醇利用 土豆培养基 生长需求物 菌株 D-02 + + + + + + + + + + + + b
1.3.6发酵条件优化 1.3.6.1pH的影响 将初始pH值设定为6.0，6.5，7.0，7.5 和8.0，研究pH值对L-色氨酸产量的影响。 1.3.6.2温度的影响 将发酵温度分别控制为28℃、30℃、 32℃、34℃和36℃，研究温度对L-色氨酸 产量的影响。 1.3.6.3装液量的影响 将装液量分别控制为15mL、20mL、 25mL、30mL和40mL，研究装液量对L-
8
L-色氨酸产量（g/L）
7 6 5 4 3 2 1 0 28 30 32 34 发酵温度(℃) 36
图 5 温度对 L- 色氨酸发酵的影响
2.4.3装液量的影响 装液量对L-色氨酸的产量的影响如图6所 示，由图可知，当装液量为25mL时，色氨酸 产量最高，为7.4g/L。15mL ～ 25mL时色氨酸 产量逐渐升高，25mL～40mL时，色氨酸产量 逐渐降低。
讨论
3.1 菌株的选育 此试验直接在土样中筛选出了L-色氨酸生成菌， 如果在培养时加入色氨酸结构类似物5-氟-DL-色 氨酸(5FT)、6-氟-DL-色氨酸(6FT)和5-甲基-DL色氨酸(5MT),则有利于直接分离筛选出具备了在 细菌生物合成L-色氨酸代谢途径中部分或者完全性 地解除了特异性限制、反馈抑制或者阻遏作用等种 种影响L-色氨酸合成的内在因素、有可能过量积累 L-色氨酸的细菌菌株,有助于L-色氨酸的大量生成。
1.2 实验设备
高温灭菌锅 北京永光明医疗仪器厂 ALC110.4电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 DK-S24型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 台式离心机 上海安亭科学仪器厂 SW-CJ-1G型净化工作台 苏州净化设备有限公司 SK-1快速混匀器 金坛市富华仪器有限公司 SHP-2500型低温生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司 往复式摇床(振幅10.5cm) 天津轻院机电厂制造 OLYMPUS生物显微镜 日本OLYMPUS会社 三角瓶（300mL） 若干 培养皿 若干 试管（15×150 18×180） 若干 pH试纸、玻璃棒、移液枪、枪尖、离心管、载玻片、盖玻片各若干。
100 80
致死率(%)
60 40 20 0 0 30 60 90 120 紫外线照射时间(s) 150
图2 不同照射时间下的致死率
通过对菌株D-02诱变，再进行摇管初 筛和摇瓶复筛最后得到的产色氨酸菌株， 在经摇瓶发酵72小时后，其色氨酸产量为 6.70g/L，其产酸能力明显提高，并有望达 到工业生产水平。 2.3色氨酸产生菌的鉴定 对产色氨酸菌株D-02进行革兰氏染 色， 显阳性。（图3）并参照根据《伯杰氏细菌 分类手册》(第八版)，采用鉴定培养基对菌 株D-02进行了多项有关分类鉴定方面的性 能分析试验，结果如表3。
8 7 6 5 4 3 2 1 0 15 20 25 30 40 250mL三角瓶装液量(mL)
图6 装液量对L-色氨酸发酵的影响
L-色氨酸产量（g/L）
2.5菌株的保藏 经过试验筛选出合适的菌株后，需要对菌株进行保藏。 在无菌条件下，从相应斜面上挑取一大环菌株D-02接入盛有 1mL冻存液的1.5mL离心管中，标记为“L-tryptophan高产菌 株D-02”，放入冰箱中冻存。 2.6结论 A. 根据微生物菌株色氨酸的代谢途径设计的细菌选择性培养 基，大大增加了菌种筛选的定向性，直接、高效、迅速地 筛选L-色氨酸生产菌株。 B. 从土壤分离的细菌经过初筛和复筛试验，得到了1株L-色 氨酸生产菌株。经过菌落形态观察和分类鉴定试验，初步确定 为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutanicum) 。 C. 菌株D-02，在经过紫外线照射的诱变育种后，色氨酸产量由 0.76g/L增加到6.70g/L，增加了近9倍。在最适pH为7.0，最适 温度为32℃，最佳装液量为25mL下，其产酸量由6.70g/L 变 为7.60g/L，而且遗传形状稳定，具有较高的实际工业化开发 应用潜力。
3.2 发酵条件的分析与思考 对于谷氨酸棒杆菌来说，其最适生长pH值为6.5 ~ 7.5，发酵初期必须使接入发酵培养基中的种子大量扩 增，故初始pH应控制在谷氨酸棒杆菌生长的pH7.0左右。 另外在发酵培养中由于硫酸按的消耗，以及葡萄糖的消 耗产生酸性物质，会造成培养基的pH不断下降，为保持 pH的稳定，可在发酵培养基中加入2%碳酸钙以稳定pH。 色氨酸发酵温度一般控制在30℃~32℃，而色氨酸 发酵的最佳温度与色氨酸生产菌的最适生长温度大致相 同。故发酵过程中菌体的生长和色氨酸的积累在一定程
C. 斜面培养基：牛肉膏蛋白胨细菌培养基。 D. 复筛发酵培养基（%） 蔗糖10.0，玉米浆2.0，吲哚0.1， K2HPO4 0.05，KH2PO4 0.05，MgSO4 0.025，FeSO4 10mg/L，MnSO4 10mg/L， CaCO3 2.0（分别灭菌），用NaOH 和HCl 调pH至7.2，115℃” :阳性， “- ” :阴性。
表3结果显示D-02与谷氨酸棒杆菌所显示的特征几乎完全
相同 ，因此，初步确定它是谷氨酸棒状杆(Corynebacterium glutanicum)，与目前谷氨酸钠(味精)工业化生产所使用的菌 种一样，是安全性高的微生物菌株。 2.4发酵条件对色氨酸的影响 2.4.1 pH的影响 初始pH值不同对发酵的影响如图4所示。由图4得知，谷 氨酸棒状杆菌的发酵培养基的最适初始pH值在7.0，在此条 件下摇瓶发酵L-色氨酸产量为7.5g/L。pH在6～7时，色氨酸 产量随pH升高而增加；在7～8时，色氨酸产量随pH升高而 降低。
国内外的现状和展望
国内主要是高价格限制了色氨酸的生产，世 界主要生产色氨酸的国家是日本。随着科学 技术的不断进步，世界色氨酸工业将会有长 足的发展，L-色氨酸的市场前景令人乐观。
实验材料和方法
1.1 实验材料与试剂
土样(按土样采集标准方法采集)；吲哚； 蛋白胨；牛肉膏；(NH4)2SO4；KH2PO4； MgSO4· 2O；CaCO3；蒸馏水；琼脂； 7H NaCl；制霉菌素；玉米浆；NaNO2；葡萄 糖；色氨酸标准溶液。
色氨酸产量的影响。 1.3.7菌株的鉴定 根据《伯杰氏细菌分类手册》(第八版)， 镜检分类鉴定所筛菌株。 1.3.8菌株的保藏 在无菌条件下，从相应斜面上挑取一大 环菌体（因为在冻存过程中会有部分菌体 死亡）接入盛有1 mL冻存液的1.5mL离心 管中，做好标记，然后放入-20℃冰箱中冻 存。
结果与分析
度上呈现出同步性，在32℃时，发酵产酸量最高，温度太低 或太高，则难以完成对原料的转化。 色氨酸发酵属于好气性发酵，溶解氧对色氨酸发酵有密 切关系，发酵过程中应保证通风，以满足菌种生长和产酸的 需要。为简化起见，采用固定摇床转速，在500mL三角瓶 中装入不同量的发酵培养基的方法来改变通风量。在500 mL摇瓶条件下，若装液量太少，则水份在长时间的发酵过 程中挥发较多，造成底物浓度过大，从而影响产酸，而装液 量过多则溶氧不足，产酸量也不高。应选择500mL三角瓶 装30mL为佳。
1.3 实验方法 1.3.1培养基的制备 A. 细菌选择性培养基 (%) 葡萄糖1.0，牛肉膏1.0，酵母膏 0.5，蛋白胨 1.0 ，NaCl 0.3，吲哚 0.1，制霉菌素50μg/L， 琼脂粉1.6，用NaOH和HCl调pH至7.2，115℃下 灭菌30分钟。 B. 种子和平板培养基（%） 葡萄糖 4.0，(NH4)2SO4 0.4，酵母膏0.5，玉米 浆 3.0，吲哚0.1，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.1， MgSO4· 2O 0.025，FeSO4· 2O 10mg/L， 7H 7H MnSO410mg/L，用NaOH 和HCl调pH至7.2， 115℃下灭菌30分钟。
0.204 0.05 0.37 0.08 0.396 0.1
OD600 色氨酸 (g/L)
0.014 0.04
0.8 0.2
1.564 0.4
0.5
色氨酸（g/L）
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 OD600 1 1.2 1.4 1.6
图1L-色氨酸标准曲线
由图1可知，L-色氨酸含量与OD值之间形成 一条密切的直线关系。经线性回归，得到回 归方程:Y=0.253X，测得复筛菌株D-02OD为 1.025，计算得色氨酸含量为0.26g/L。再经 摇瓶发酵72小时后色氨酸产量达到0.76g/L。 2.2色氨酸产生菌的诱变选育 通过紫外线的诱变，测定了紫外线的不同 照射时间对出发菌株的致死率的影响，结果 如图2所示。根据图所示结果，紫外线诱变处 理的最佳时间为60秒。
1.3.2土样采集 参照土样采集标准方法，从麦田，树林， 草丛，臭水沟等处采集土样和水样。 1.3.3富集培养 取1g土样加入盛有10mL无菌水的试管 中，震荡摇匀后取5mL悬浮液加入盛有25 mL选择性培养基的三角瓶中，30℃、150 r/min培养3-5天后。 1.3.4 菌株的筛选 1.3.4.1菌株的初筛
L-色氨酸生产菌的诱变筛选及 鉴定
作 者 姓 名 专 业 指导教师姓名 专业技术职务
李 军 生物工程 陈 静 副教授
主要内容
本课题的目的和意义 国内外的现状和展望 实验材料和方法 结果与分析 讨论
本课题的目的和意义
本课题利用细菌生物合成L-色氨酸代谢途径 的特点，设计了分离筛选产色氨酸菌株的细 菌选择性培养基，并通过初筛和复筛，从土 壤中筛选到几株产色氨酸的野生菌株，并通 过诱变，进一步提高产色氨酸水平，有望达 到工业化生产的要求.