L-色氨酸生产菌的筛选

A. 平板分离：将经富集培养的菌液用无菌水 适当稀释，取一定量涂布分离平板。30℃ 培养2-3天，将单菌落挑至斜面上保藏。 B. 菌株的初筛：将菌株发酵培养后取发酵液， 离心，上清液用对二甲胺基苯甲醛法显色， 以目测法选出呈深蓝色者，作为产色氨酸 菌株，留作复筛用。 1.3.4.2 菌株的复筛
将初筛获得的产色氨酸菌株再进行发酵 培养，发酵液离心后取上清液用对二甲胺 基苯甲醛法显色后，用 分光光度计于测定 吸光度，并与根据色氨酸标准曲线计算出 色氨酸的含量。 1.3.5 菌株的诱变 紫外诱变的意义：通过对复筛菌株的诱 变，选出产色氨酸量高且遗传性状稳定的 菌株。
图3 菌株D-02的革兰氏染色图
表3复筛分离菌株的生理生化性质
性质 硝酸盐还原 脲酶 淀粉水解 胨化石蕊 葡萄糖利用 蔗糖利用 木糖利用 乳糖利用 果糖利用 阿拉伯糖利用 鼠李糖利用 淀粉利用 甘露醇利用 山梨醇利用 土豆培养基 生长需求物 菌株 D-02 + + + + + + + + + + + + b
讨论
3.1 菌株的选育 此试验直接在土样中筛选出了L-色氨酸生成菌， 如果在培养时加入色氨酸结构类似物5-氟-DL-色 氨酸(5FT)、6-氟-DL-色氨酸(6FT)和5-甲基-DL色氨酸(5MT),则有利于直接分离筛选出具备了在 细菌生物合成L-色氨酸代谢途径中部分或者完全性 地解除了特异性限制、反馈抑制或者阻遏作用等种 种影响L-色氨酸合成的内在因素、有可能过量积累 L-色氨酸的细菌菌株,有助于L-色氨酸的大量生成。
1.3.2土样采集 参照土样采集标准方法，从麦田，树林， 草丛，臭水沟等处采集土样和水样。 1.3.3富集培养 取1g土样加入盛有10mL无菌水的试管 中，震荡摇匀后取5mL悬浮液加入盛有25 mL选择性培养基的三角瓶中，30℃、150 r/min培养3-5天后。 1.3.4 菌株的筛选 1.3.4.1菌株的初筛
8
L-色氨酸产量（g/L）
7 6 5 4 3 2 1 0 28 30 32 34 发酵温度(℃) 36
图 5 温度对 L- 色氨酸发酵的影响
2.4.3装液量的影响 装液量对L-色氨酸的产量的影响如图6所 示，由图可知，当装液量为25mL时，色氨酸 产量最高，为7.4g/L。15mL ～ 25mL时色氨酸 产量逐渐升高，25mL～40mL时，色氨酸产量 逐渐降低。
生物量 (OD) 1.012 0.908 1.025 1.015 0.650 0.804
色氨酸反应显色 程度 ++ ++ +++ ++ ++ ++
注: “+ + +” 、 “+ +” 和 “+” 分别表示反应显色的颜色深度:蓝 色 一级(深蓝色) 、 二级(藏蓝色)和三级(蓝色) 。 2.1.2色氨酸菌株的复筛 将这6株菌株作为复筛试验进行复筛。其中，蓝色较 深的菌株有1株，为D-02，表明可能产生较大量的色氨 酸。 通过对色氨酸标准溶液进行稀释侧OD，得出 色氨酸标准曲线图如表2、图1。 表2 L-色氨酸标准曲线数据
注:b :生物素; “+” :阳性， “- ” :阴性。
表3结果显示D-02与谷氨酸棒杆菌所显示的特征几乎完全
相同 ，因此，初步确定它是谷氨酸棒状杆(Corynebacterium glutanicum)，与目前谷氨酸钠(味精)工业化生产所使用的菌 种一样，是安全性高的微生物菌株。 2.4发酵条件对色氨酸的影响 2.4.1 pH的影响 初始pH值不同对发酵的影响如图4所示。由图4得知，谷 氨酸棒状杆菌的发酵培养基的最适初始pH值在7.0，在此条 件下摇瓶发酵L-色氨酸产量为7.5g/L。pH在6～7时，色氨酸 产量随pH升高而增加；在7～8时，色氨酸产量随pH升高而 降低。
3.2 发酵条件的分析与思考 对于谷氨酸棒杆菌来说，其最适生长pH值为6.5 ~ 7.5，发酵初期必须使接入发酵培养基中的种子大量扩 增，故初始pH应控制在谷氨酸棒杆菌生长的pH7.0左右。 另外在发酵培养中由于硫酸按的消耗，以及葡萄糖的消 耗产生酸性物质，会造成培养基的pH不断下降，为保持 pH的稳定，可在发酵培养基中加入2%碳酸钙以稳定pH。 色氨酸发酵温度一般控制在30℃~32℃，而色氨酸 发酵的最佳温度与色氨酸生产菌的最适生长温度大致相 同。故发酵过程中菌体的生长和色氨酸的积累在一定程
0.204 0.05 0.37 0.08 0.396 0.1
OD600 色氨酸 (g/L)
0.014 0.04
0.8 0.2
1.564 0.4
0.5
色氨酸（g/L）
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0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 OD600 1 1.2 1.4 1.6
图1L-色氨酸标准曲线
由图1可知，L-色氨酸含量与OD值之间形成 一条密切的直线关系。经线性回归，得到回 归方程:Y=0.253X，测得复筛菌株D-02OD为 1.025，计算得色氨酸含量为0.26g/L。再经 摇瓶发酵72小时后色氨酸产量达到0.76g/L。 2.2色氨酸产生菌的诱变选育 通过紫外线的诱变，测定了紫外线的不同 照射时间对出发菌株的致死率的影响，结果 如图2所示。根据图所示结果，紫外线诱变处 理的最佳时间为60秒。
100 80
致死率(%)
60 40 20 0 0 30 60 90 120 紫外线照射时间(s) 150
图2 不同照射时间下的致死率
通过对菌株D-02诱变，再进行摇管初 筛和摇瓶复筛最后得到的产色氨酸菌株， 在经摇瓶发酵72小时后，其色氨酸产量为 6.70g/L，其产酸能力明显提高，并有望达 到工业生产水平。 2.3色氨酸产生菌的鉴定 对产色氨酸菌株D-02进行革兰氏染 色， 显阳性。（图3）并参照根据《伯杰氏细菌 分类手册》(第八版)，采用鉴定培养基对菌 株D-02进行了多项有关分类鉴定方面的性 能分析试验，结果如表3。
2.1色氨酸产生菌的筛选 2.1.1色氨酸菌株的初筛 采用摇管培养方法对分离的132株细菌进行 产酸能力初筛，表1结果表明，用对二甲胺基 苯甲醛对摇管发酵液进行显色后，其中有6株 菌株出现了蓝色变化（表1）。
表1 主要初筛菌株的色氨酸产生结果
序号
菌种编号
1
2 3 4 5 6
B-02
C-04 D-02 H-01 H-03 S-05
8 7
L-色氨酸浓度/g/L
6 5 4 3 2 1 0 6 6.5 6.8 7 pH 7.2 7.5 8
图4
初始 pH值对菌体生长和发酵的影响
2.4.2 温度的影响 温度对L-色氨酸发酵的影响见图5。由 图5可知，L-色氨酸发酵的最适温度为32℃。 在32℃温度下，菌体生长好，菌体量大，L色氨酸产量高。温度在28℃～32℃时，L-色 氨酸产量随温度上升而增加；在32℃～36℃ 时，L-色氨酸产量随温度上升而降低。
1.2 实验设备
高温灭菌锅 北京永光明医疗仪器厂 ALC110.4电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 DK-S24型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 台式离心机 上海安亭科学仪器厂 SW-CJ-1G型净化工作台 苏州净化设备有限公司 SK-1快速混匀器 金坛市富华仪器有限公司 SHP-2500型低温生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司 往复式摇床(振幅10.5cm) 天津轻院机电厂制造 OLYMPUS生物显微镜 日本OLYMPUS会社 三角瓶（300mL） 若干 培养皿 若干 试管（15×150 18×180） 若干 pH试纸、玻璃棒、移液枪、枪尖、离心管、载玻片、盖玻片各若干。
1.3 实验方法 1.3.1培养基的制备 A. 细菌选择性培养基 (%) 葡萄糖1.0，牛肉膏1.0，酵母膏 0.5，蛋白胨 1.0 ，NaCl 0.3，吲哚 0.1，制霉菌素50μg/L， 琼脂粉1.6，用NaOH和HCl调pH至7.2，115℃下 灭菌30分钟。 B. 种子和平板培养基（%） 葡萄糖 4.0，(NH4)2SO4 0.4，酵母膏0.5，玉米 浆 3.0，吲哚0.1，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.1， MgSO4· 2O 0.025，FeSO4· 2O 10mg/L， 7H 7H MnSO410mg/L，用NaOH 和HCl调pH至7.2， 115℃下灭菌30分钟。
度上呈现出同步性，在32℃时，发酵产酸量最高，温度太低 或太高，则难以完成对原料的转化。 色氨酸发酵属于好气性发酵，溶解氧对色氨酸发酵有密 切关系，发酵过程中应保证通风，以满足菌种生长和产酸的 需要。为简化起见，采用固定摇床转速，在500mL三角瓶 中装入不同量的发酵培养基的方法来改变通风量。在500 mL摇瓶条件下，若装液量太少，则水份在长时间的发酵过 程中挥发较多，造成底物浓度过大，从而影响产酸，而装液 量过多则溶氧不足，产酸量也不高。应选择500mL三角瓶 装30mL为佳。
色氨酸产量的影响。 1.3.7菌株的鉴定 根据《伯杰氏细菌分类手册》(第八版)， 镜检分类鉴定所筛菌株。 1.3.8菌株的保藏 在无菌条件下，从相应斜面上挑取一大 环菌体（因为在冻存过程中会有部分菌体 死亡）接入盛有1 mL冻存液的1.5mL离心 管中，做好标记，然后放入-20℃冰箱中冻 存。
结果与分析
L-色氨酸生产菌的诱变筛选及 鉴定
作 者 姓 名 专 业 指导教师姓名 专业技术职务
李 军 生物工程 陈 静 副教授
主要内容
本课题的目的和意义 国内外的现状和展望 实验材料和方法 结果与分析 讨论
本课题的目的和意义
本课题利用细菌生物合成L-色氨酸代谢途径 的特点，设计了分离筛选产色氨酸菌株的细 菌选择性培养基，并通过初筛和复筛，从土 壤中筛选到几株产色氨酸的野生菌株，并通 过诱变，进一步提高产色氨酸水平，有望达 到工业化生产的要求.
C. 斜面培养基：牛肉膏蛋白胨细菌培养基。 D. 复筛发酵培养基（%） 蔗糖10.0，玉米浆2.0，吲哚0.1， K2HPO4 0.05，KH2PO4 0.05，MgSO4 0.025，FeSO4 10mg/L，MnSO4 10mg/L， CaCO3 2.0（分别灭菌），用NaOH 和HCl 调pH至7.2，115℃下灭菌30分钟。
国内外的现状和展望
国内主要是高价格限制了色氨酸的生产，世 界主要生产色氨酸的国家是日本。随着科学 技术的不断进步，世界色氨酸工业将会有长 足的发展，L-色氨酸的市场前景令人乐观。
实验材料和方法
1.1 实验材料与试剂
土样(按土样采集标准方法采集)；吲哚； 蛋白胨；牛肉膏；(NH4)2SO4；KH2PO4； MgSO4· 2O；CaCO3；蒸馏水；琼脂； 7H NaCl；制霉菌素；玉米浆；NaNO2；葡萄 糖；色氨酸标准溶液。
8 7 6 5 4 3 2 1 0 15 20 25 30 40 250mL三角瓶装液量(mL)
图6 装液量对L-色氨酸发酵的影响
L-色氨酸产量（g/L）
2.5菌株的保藏 经过试验筛选出合适的菌株后，需要对菌株进行保藏。 在无菌条件下，从相应斜面上挑取一大环菌株D-02接入盛有 1mL冻存液的1.5mL离心管中，标记为“L-tryptophan高产菌 株D-02”，放入冰箱中冻存。 2.6结论 A. 根据微生物菌株色氨酸的代谢途径设计的细菌选择性培养 基，大大增加了菌种筛选的定向性，直接、高效、迅速地 筛选L-色氨酸生产菌株。 B. 从土壤分离的细菌经过初筛和复筛试验，得到了1株L-色 氨酸生产菌株。经过菌落形态观察和分类鉴定试验，初步确定 为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutanicum) 。 C. 菌株D-02，在经过紫外线照射的诱变育种后，色氨酸产量由 0.76g/L增加到6.70g/L，增加了近9倍。在最适pH为7.0，最适 温度为32℃，最佳装液量为25mL下，其产酸量由6.70g/L 变 为7.60g/L，而且遗传形状稳定，具有较高的实际工业化开发 应用潜力。
1.3.6发酵条件优化 1.3.6.1pH的影响 将初始pH值设定为6.0，6.5，7.0，7.5 和8.0，研究pH值对L-色氨酸产量的影响。 1.3.6.2温度的影响 将发酵温度分别控制为28℃、30℃、 32℃、34℃和36℃，研究温度对L-色氨酸 产量的影响。 1.3.6.3装液量的影响 将装液量分别控制为15mL、20mL、 25mL、30mL和40mL，研究装液量对L-