第08章 真核生物的遗传分析(XXXX)

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家猪X、Y染色体G带示意图
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细胞遗传标记的特点
❖ 不易受环境影响，呈孟德尔方式遗传。 ❖ 多态性集中表现在染色体高度重复DNA结构
的异染色质所在的部位。 ❖ 细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效
应，难以获得相应的标记材料，或者观测和 鉴定比较困难，从而限制了细胞遗传标记的 应用。
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3、生化与免疫遗传标记
据大小不同，可分为 短散布核元件（short interspersed nuclear
element, SINE） 长散布核元件（ long interspersed nuclear
element, LINE ）
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三、 DNA序列分析方法
❖ DNA 测序技术早在DNA 双螺旋结构 (Watson and Crick, 1953) 发现后不久就有 报导(Whitfeld,1954)，
分布在不同的染色体上 独立的转录单位 基因顺序与表达顺序相关 ◆代表:珠蛋白基因家族
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根据基因家族成员序列的相似程度分类
A 经典的基因家族，家族成员序列有高度的同源性，序列一致，拷贝数高， 非转录间隔区短而一致。
B 基因家族各成员的编码产物保守（大段的高度保守氨基酸序列）；只是 DNA序列的相似性低。
❖ M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学 家全都获得了诺贝尔奖。
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❖ Sanger 等(1977)：末端终止法，该技术引入 了聚合酶和测序胶，使DNA 测序走向了大规 模实用化。
❖ 经过Melamede, 1985; Cheesman, 1991;Metzker et al., 1994等改良后成为迄今 为止应用最为广泛的测序技术。
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二、基因组序列的分类
（一）单一序列（Unique sequence）
又称非重复序列（nonrepetitive sequence），在基 因组中只有一个或几个拷贝的DNA序列，大多数结 构基因都属于这一类。
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（二）重复序列 1、串联重复DNA序列
只存在于真核基因组，由2~200bp的重复单 位组成
C 基因家族各成员的编码产物之间只有很短的保守氨基酸序列，DNA序列 的相似性更低。
D 超基因家族，各基因序列之间无同源性，但其基因产物的功能相似。编 码产物之间也无明显的保守氨基酸序列，但也有一些共同特征。
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第三节 遗传标记
❖ 一、遗传标记的发展 ❖ 二、分子遗传标记 ❖ 三、分子遗传标记的应用
依据它进行选择的准确性差，所需时间较长，选 择效率也较低。
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古代形态学标记
❖ 公元前4000年，伊拉克的古代巴比伦石刻上 记载了马头部性状在５个世代的遗传。
wk.baidu.com40
伯乐相马
按图索骥
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2、细胞遗传标记
❖ 细胞遗传标记(cytological genetic marker)
主要是指染色体核型（染色体数目、大小、随体、 着丝粒位置、核仁组织区等）、带型（Q、G、C、 R带型）和数量特征的变异等，它们分别反映了染 色体在结构上和数量上的遗传多态性。
❖ 当时的测序的方法为降解法(sequencing by degradation, SbD)，
❖ 但由于操作复杂，并没有形成规模化的应用。
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❖ 1965，Cornall大学以S．W．Holle为首的 科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙 氨酸tRNA的全序列测定。
❖ 即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸， 经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。
状基因，还是与影响重要性的性状连锁。 ❖ 实验重复性好（便于数据交换）； ❖ 开发成本和使用成本尽量低廉；
❖ 随着技术的改进和创新(Ju et al., 2000;Church, 2002; Barnes et al., 2002; Mitra et al., 2003)，聚合酶测序法又有了新 的发展。
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另外，还有许多其他的测序策略：
❖ 如连接酶测序法(sequencing by ligation, SbL) (Whiteley et al., 1984; Landegren and Hood, 1988;Drmanac, 1992)、
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❖ 1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士 （Dr．Ray Wu） 独创性地设计出一种崭新的引物 一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ 噬菌体两个COS末端的完整序列；
❖ 1977，F. Sanger在该策略的基础上，发展出了快 速测定DNA序列的末端中止法；
❖ K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方 法；
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第二节 基因家族
真核基因组中来源相同，结构相似，功能相 关的一组基因。
可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经 重复(duplication)和突变产生。
家族成员可以分布于不同染色体上
可集中于一条染色体上，串联排列在一起，形成基因簇 (gene cluster)
有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基 因(Pseudogene)
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（二）重复序列
1、串联重复DNA序列 ❖ 卫星DNA（Satellite DNA）
在进行密度梯度离心时，某些高度重复DNA序列 由于碱基组成和浮力密度与主体DNA有区别，会 形成一系列的卫星带
主带：多由单拷贝序列组成，GC含量接近于基 因组均值
卫星DNA
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卫星DNA
❖ 一般位于异染色质区，通常位于着丝粒 ❖ 在染色体中可能有某种结构功能 ❖ 长度为100kb~数Mb
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2、化学降解法
❖ 1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和 W． Gilbert发明，
❖ 于1980年获得诺贝尔化学奖
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原理
❖ 1、利用末端标记使待测DNA带放射性， ❖ 2、利用不同化学药品使DNA分别在特定碱基
处断裂， ❖ 3、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组大小不
同的DNA片段，根据特定的断裂位置读出 DNA序列
组蛋白基因家族
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❖ 假基因（pseudo gene）：具有与功能基因相似 的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的 功能，所以假基因是没有功能的基因，用ψ表 示。
❖ 来源：一般认为是由mRNA反转录成cDNA， 然后整合在基因组中，
❖ 假基因不含内含子。
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ζ
ψζψα ψα α2 α1 θ
ε
Gγ Aγ ψβ δ β
T
A
A
G
C G T T G
T C A G
A
G
C
A
G
T
C
C
C
A
C
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C
❖ 在实际的DNA合成反应中，使用失去了5’ →3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的 Klenow大片段。适当地调整ddNTP和dNTP 的比例，便能够获得良好的电泳谱带模式。
❖ dNTP／ddNTP=1：100时，谱带分离效果较 佳，可读出多于 200个以上的核苷酸顺序。
图 10-30 人 类 血 红 蛋 白 的 α 和β 基 因 簇
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B 散布的基因家族（interspersed gene family） ❖ 概念：一个基因家族的不同成员成簇地分布
不同染色体上，各成员在序列上有明显差异。 ❖ 这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋
白质，如珠蛋白基因家族。
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根据基因家族在基因组中的复杂程度分类
❖ 焦磷酸测序法(pyrosequencing) (Hyman,1988) ❖ 杂交测序法(sequencingbyhybridization, SbH)
(Drmanac et al., 1989; 1998; 2001)
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1、Sanger测序法
双脱氧末端终止法
利用DNA聚合酶的两种酶 催反应特性：1、利用单链 DNA模板，合成DNA互补 链；2、利用2’，3’双脱 氧核苷三磷酸作底物，参 入到寡核酸链的末端，从 而终止DNA链的生长。有 时也称引物合成法，或酶 催引物合成法。
❖ 与形态学标识和细胞遗传标记相比，数量更 丰富，受环境影响更小，检测手段简便，是 一种较好的遗传标记。
❖ 血液型和蛋白质型都是基因表达的产物，局 限于反映基因组编码区的遗传信息，且标记 的数量还比较有限，不能很好地覆盖整个基 因组。
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4、分子遗传标记
分子遗传标记(molecular genetic marker) 是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标记. 随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、 VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗 传标记检测技术，开创了遗传标记研究的新 阶段。
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根据分布形式分基因簇和散布的基因家族：
A 基因簇（gene cluster） ❖ 基因家族的各个成员紧密成簇排列成大段的串联重
复单位，分布在某一条染色体的特殊区域； ❖ 它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质。 ❖ 如 组蛋白基因家族聚集在第7号染色体长臂3区内
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Histone gene family
❖ （1）EG位于细胞核中，由数条具有多级空 间结构的染色体组成；
❖ （2）具有多个复制起点，基因内有内含子； ❖ （3）存在着大量的非编码DNA序列；
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❖ （4）编码蛋白质的基因多位于单拷贝序列中， 同时还有大量的重复序列；
❖ （5）具有基因家族和基因簇； ❖ （6）具有生命所必须的细胞器基因组
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1）简单基因家族 ◆ 特点：
家族成员串联排列在一起 组成一个转录单位 ◆ 代表:
rRNA基因家族 (重复单元28S、18S、5.8s-rRNA)
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2）复杂基因家族 ◆ 特点： 相关基因家族排列在一起，之间有间隔序列， 独立的转录单位 ◆ 代表: 组蛋白基因家族
间隔区
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3）发育相关复杂基因家族 ◆特点：
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反应：同时加入引物和 模板、DNA聚合酶I、一 种ddNTP、以及四种 dNTP（有一种带放射性 标记）。
变性胶电泳分离反应混 合物。
放射自显影术，检测单 链DNA片段的放射性带。 结果判读，从放射性X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
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ddATP ddTTPddGTP ddCTP
G ddCTP ddATP ddGTP ddTTP
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分子遗传标记的特点
❖ 无表型效应 ❖ 不受环境的限制和影响 ❖ 普遍存在于所有生物 ❖ 数量丰富
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理想的分子遗传标记应具备的特点
❖ 遗传多态性高; ❖ 检测手段简单快捷，易于实现自动化; ❖ 遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种
基因型。 ❖ 标记遍布整个基因组； ❖ 准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济性
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一、遗传标记的发展
❖ 1、形态学标记 ❖ 2、细胞遗传标记 ❖ 3、生化与免疫遗传标记 ❖ 4、分子遗传标记 ❖ 5、理想的分子遗传标记应具备的特点
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1、形态学标记
❖ 形态学标记(morphological marker)
能够用肉眼识别和观察、明确显示遗传多样性的 外观性状。
❖ 特点
简单直观，但标记数目少，多态性低，易受外界 条件的影响；
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可变数目串联重复序列
❖ Variable number of tandem repeat,VNTR ❖ 卫星DNA中，有一类重复单位在11~60bp，
总长度为几百到几千bp的重复序列，多位于 近端粒处 ❖ 根据重复单位的大小又可分为：卫星DNA、 小卫星DNA和微卫星DNA三类，这类DNA多 不具备转录能力
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小卫星DNA
❖ 核心重复序列由10~25bp组成 ❖ 总长度为0.1~30kb ❖ 多位于靠近染色体末端的区域，也称端粒小
卫星，
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微卫星DNA
❖ 由1~6个核苷酸为核心序列 ❖ 分散于整个基因组 ❖ 总长度<150bp
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（二）重复序列
2、散布的重复DNA序列 在高度分散的重复DNA家族中含有少量转座元件，根
❖ 免疫遗传学标记(immunogenetical marker)
以动物的免疫学特性为标记，包括红细胞抗原多态性和白细 胞抗原多态性。
❖ 生化遗传标记(biochemical genetic marker)
主要是指在同一动物个体中具有相同功能的蛋白质存在两种 以上的变异体。
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生化与免疫遗传标记的特点
第八章 真核生物的遗传分析
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本章要掌握的主要内容
❖ 第一节 真核生物基因组及其复杂性
真核生物基因组的特点 重复序列的分类 DNA序列分析方法与结构基因组学
❖ 第二节 基因家族
基因家族的类型，基因家族的特点
❖ 第三节 遗传标记
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第一节 真核生物基因组及其复杂性
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一、真核生物基因组的特点
❖ 真核生物基因组（Eukaryotic Genome, EG） 与原核生物基因组（Prokaryotic Genome, PG）相比有很大差异：