ww一种简便的外周血干细胞冷冻保存法
外周血干细胞冻存的探讨_叶韵斌
近十年以来 , 造血干细胞的移植已越来越广泛地 ma 公司 产品 。 集落 培养 所需 的试剂 (甲 基纤维 素 ,
应用于血液病及实体瘤的治疗 。但造血干细胞移植的 SCF , IL-3 , IL-6)为加拿大 S temcell 公司产品 , G -CSF
成功与否 , 很重要的一点取决于造血干细胞的冻存以 GM -CSF 及部分因子 SCF , IL -3 , IL -6 由麒麟公司
二 、单纯用 10 %DM SO 作冻存剂 , 自体血浆的加 入 , 可显著提高冻存细胞的活力 。 见表 4 。 血浆比例 越大 , 冻存过程中越能维持细胞的活力 。
三 、采用 10 %DM SO 作冻存剂 , -80 ℃冻存干细 胞的方法治疗 7 例肿瘤病人 , 对其 14 份样品作冻存前 后细胞活性 、CD34阳性细胞比例 、CFU-G M 检测 , 结果 见表 5 。 其余 2 例用 5 % DMSO , 6 % HES , 以及 4 % Alb , -80 ℃低温冰箱冻存干细胞的方法 , 9 例患者 , 回 输 CD34量平均每公斤体重 1 .46 ×107(6 .6 ×105 ～ 4 . 86 ×107), CFU-G M 每公斤体重 3 .85 ×105(2 .3 ×104 ～ 8 .04 ×105), 回输干细胞后平均 17 天(12 ～ 20)恢复
表 4 自体血浆比 例对冻存效果的影响(N =3)
自体血浆 (体积分数)
0
10
水浴复苏 , 测细胞活力 , CD 34 阳性细胞比 率 , 及 CF UGM 数。
结 果 一 、比较不同的冻存液 , 不同的冻存条件 , 以及不 同的冻存时间对细胞的活力 、CD34阳性细胞比例以及 CF U-GM 的影响 。 见表 1 , 2 , 3 。
外周血单个核细胞的冻存方法[发明专利]
![外周血单个核细胞的冻存方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ad3f038368dc5022aaea998fcc22bcd126ff42a8.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011124306.X(22)申请日 2020.10.20(71)申请人 广州准优生物科技有限公司地址 510000 广东省广州市开发区国际生物岛螺旋四路第五号第6层602、603单元(72)发明人 吴道贫 陶然 覃绍君 赖小华 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人 戴志攀(51)Int.Cl.A01N 1/02(2006.01)(54)发明名称外周血单个核细胞的冻存方法(57)摘要本发明涉及一种外周血单个核细胞的冻存方法，包括以下步骤：将外周血单个核细胞与预处理液混合，于‑10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。
本发明通过二步法对PBMC进行处理，并在预处理液及冻存液中配合加入特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合对PBMC进行冻存保护，能够显著地提高长时间冻存后复苏PBMC 细胞的数量、活性，并维持其功能，确保PBMC长期低温冻存的效率。
权利要求书1页 说明书9页CN 112219838 A 2021.01.15C N 112219838A1.一种外周血单个核细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、ROCK激酶抑制剂、DMSO和血清。
2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/L～150mmol/L，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/L～0.375mmol/L。
一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910726436.1(22)申请日 2019.08.07(71)申请人 广东万海细胞生物科技有限公司地址 523808 广东省东莞市松山湖高新技术产业开发区创新科技园9栋208室(72)发明人 吕品雷 何安涛 李莉 李相鲁 (74)专利代理机构 东莞市华南专利商标事务所有限公司 44215代理人 李锦华(51)Int.Cl.A01N 1/02(2006.01)C12N 5/078(2010.01)(54)发明名称一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法(57)摘要本发明涉及一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法，冻存液，包括如下体积百分比的组分：无血清培养基40-60％、非渗透性保护剂15-25％、渗透性保护剂5-15％、透明质酸钠5-15％和抗氧化物质5-15％。
本发明采用无血清培养基+非渗透性保护剂+渗透性保护剂+抗氧化物质的冻存液组合，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。
权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 110447636 A 2019.11.15C N 110447636A1.一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：包括如下体积百分比的组分：2.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：由如下体积百分比的组分组成：3.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述无血清培养基为X -VIVO15无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为人白蛋白、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖和聚乙烯比咯烷酮中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为人白蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、丙二醇和乙二醇中的至少一种。
一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液[发明专利]
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(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510112445.3(22)申请日 2015.03.13A01N 1/02(2006.01)(71)申请人深圳普若赛斯生物科技有限公司地址518000 广东省深圳市盐田区盐田街道洪安三街国际公寓4栋1401(72)发明人林小贞 吴洁 常海龙咖博·瓦吉塔(74)专利代理机构深圳市科吉华烽知识产权事务所(普通合伙) 44248代理人王雨时 许建(54)发明名称一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液(57)摘要本发明提供了一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液，所述干细胞快速冷冻方法包括以下步骤：将干细胞在冷冻基础液中平衡；将干细胞转至1号冷冻液中平衡；将干细胞转至2号冷冻液中平衡后，将干细胞转移到载体管中；将载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，并以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中。
本发明的技术方案能够在进行快速玻璃化冷冻时更好地保护干细胞，有效地提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，并且保持冷冻复苏后干细胞的生长分化和表达能力等全能性不受影响；特别是对于一些很敏感的干细胞，复苏存活率可以提高到95%以上。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页 附图1页(10)申请公布号CN 104738028 A (43)申请公布日2015.07.01C N 104738028A1.一种干细胞快速冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A：将干细胞在36~39℃预热的冷冻基础液中平衡1~5分钟；步骤B：将干细胞转至36~39℃预热的1号冷冻液中平衡2~5分钟；步骤C：将干细胞转至36~39℃预热的2号冷冻液中平衡20~60s后，提取含有干细胞的混合液转移到载体管中；步骤D：将装载了干细胞的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液面5~10mm，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s；其中，所述1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的浓度。
一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法[发明专利]
![一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9d938129fe00bed5b9f3f90f76c66137ee064f2d.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710940304.X(22)申请日 2017.10.11(71)申请人 重庆金时代生物技术有限公司地址 400026 重庆市江北区港城东路6号6幢2-1(72)发明人 赵翔 宋彩霞 曹玉昊 叶劲涛 王仁杰 黄启程 邱阳 李国焱 唐玲 胡小东 (74)专利代理机构 重庆百润洪知识产权代理有限公司 50219代理人 高姜(51)Int.Cl.A01N 1/02(2006.01)(54)发明名称一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法(57)摘要本发明公开了一种人外周血单个核细胞的冻存液，按体积分数计，包括以下组分：二甲基亚砜8-15％、聚乙二醇6-10％、人血白蛋白5-10％，余量为勃脉力A，还包括海藻糖15-30mg/ml、羟乙基淀粉15-20mg/ml、β-葡聚糖10-20mg/ml、葡萄糖50-100mg/ml和维生素C 1-5mg/ml。
冻存方法包括：配制冻存液，提取人外周血单个核细胞，然后重悬细胞，再加入冻存液置于-80℃冻存12-14h，然后再转入液氮中保存。
采用该冻存液保存人外周血单个核细胞时，其细胞存活率高，细胞活性较强，复苏后细胞扩增周期短。
权利要求书1页 说明书5页CN 107912419 A 2018.04.17C N 107912419A1.一种人外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于，按体积分数计，包括以下组分：二甲基亚砜8-15％、聚乙二醇6-10％、人血白蛋白5-10％，余量为勃脉力A，还包括海藻糖15-30mg/ml、羟乙基淀粉15-20mg/ml、β-葡聚糖10-20mg/ml、葡萄糖50-100mg/ml和维生素C 1-5mg/ml。
2.根据权利要求1所述的人外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于，按体积分数计，包括以下组分：二甲基亚砜12％、聚乙二醇8％、人血白蛋白7％，余量为勃脉力A，还包括海藻糖25mg/ml、羟乙基淀粉18mg/ml、β-葡聚糖15mg/ml、葡萄糖50mg/ml和维生素C 3mg/ml。
—80℃低温冷冻保存人外周血造血干细胞
—80℃低温冷冻保存人外周血造血干细胞
刘开彦
【期刊名称】《新疆医学院学报》
【年(卷),期】1995(018)002
【摘要】采用６％羟乙基淀粉（ＨＥＳ）和５％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为冷冻保护剂，不用程控降温装置和液氮，直接于－８０℃冰箱中冻存外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）。
于冻存前和冻存后１周、１个月、２个月和３个月分别取样分析。
冻存３个月后，外周血单核细胞（ＭＮＣ）回收率为８９．８±６．６％；胎盼蓝拒染存活率为８０．２±５．４％；粒一单系造血祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）回收率为７１．１±８．２％。
说明冻存效果好，ＤＭＳＯ用量
【总页数】4页(P102-105)
【作者】刘开彦
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】R457.9
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-80℃冻存外周血造血干细胞的应用研究
-80℃冻存外周血造血干细胞的应用研究袁成录;史春雷;王玲;李颖;黄梅娟;王媛媛;高岱清【期刊名称】《河北医学》【年(卷),期】2006(012)009【摘要】目的:探求一种操作简便实用、造血干细胞回收率和存活率高、成本低的外周血造血干细胞的冻存方法.方法:CP-1和5%白蛋白作保护剂在–80℃条件下直接冻存,并检测冻存前后外周血干细胞的活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34+细胞的回收率.结果:冻存前后外周血干细胞活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34+细胞的回收率无明显差异(P＞0.05),输注后造血均重建.结论:CP-1和5%白蛋白作保护剂在–80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,具有广泛的临床推广价值.【总页数】3页(P864-866)【作者】袁成录;史春雷;王玲;李颖;黄梅娟;王媛媛;高岱清【作者单位】山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042;山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042;山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042;山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042;山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042;山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042;山东省青岛市中心医院内科,山东,青岛,266042【正文语种】中文【中图分类】R818.052+.1【相关文献】1.自体外周血造血干细胞(APBSC)动员采集及冻存的研究 [J], 杜娟;吴胜其;吴杨2.-80℃冰箱长期冻存外周血造血干细胞研究 [J], 陆紫敏;郑伟萍;丁懿;纪黎明;方琦;孙向华3.外周血造血干细胞的检测及冻存技术 [J], 斯晓明;黄若宇;黄颖;王九花;张亮4.-80℃简易冻存外周造血干细胞临床应用观察 [J], 覃春捷;陈宏5.低浓度二甲基亚砜冻存外周血造血干细胞的效果 [J], 靳海杰;唐菊英;孙敬芬;赵丹丹;黄文荣;刘源;高春记;达万明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
简便的造血干细胞的非程控—80℃保存
简便的造血干细胞的非程控—80℃保存
岑东;裴仁治
【期刊名称】《白血病》
【年(卷),期】1999(008)002
【摘要】目的尝试一种新的低温保存方法，方法将７例将行自体外周血干细胞移植患者的外周血干细胞浓集液和１９例小样本骨髓分别与改进后的细胞冷冻保护液混合，不经程控降温而直接将分装后的混恶液保存在－８０℃，在１周，１月，３月时取出，４０℃水溶解冻，检测细胞回收率和锥虫蓝柜染率，结果１周，１月，３月后均有较好的细胞回收率和存活率，且无显著性差异（Ｐ〉０．０５），７例患者输注经保存后的干细胞浓集液后也很快获得检
【总页数】3页(P103-105)
【作者】岑东;裴仁治
【作者单位】浙江省鄞县人民医院;浙江省鄞县人民医院
【正文语种】中文
【中图分类】R457
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直接 - 80 ℃冷冻法 将上述悬液混匀后置于 5 ml 聚乙烯冷冻管 ,4 层纱布包裹 ,夹在两层厚为 2 厘 米的聚乙烯泡沫板中间 ,直接置于 - 80 ℃冰箱中 。
人工梯度降温 - 80 ℃冷冻法 将冷冻管先置于 4 ℃中 1 小时 ,然后移到 - 20 ℃置 2 小时后再放入 - 80 ℃冰箱中保存 。
© 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
CD34 + cell 98. 8 ±4. 8 93. 9 ±4. 7 91. 1 ±5. 3
外周血干细胞冷冻保存法
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Table 2 Effect of - 80 ℃cryopreservation of PBSCs for 1 - 24 months with 5 % DMSO , 3 % HES and 4 % HSA
中国实验血液学杂志 Journal of Ex peri mental Hem atology 2001 ; 9 (4)
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一种简便的外周血干细胞冷冻保存法
张 苗 张伯龙 张佐云1 靳海杰 史子江 周 绮
(中国人民解放军总医院血液科 ,1 临床医学基础研究所低温冷冻室 北京 100853)
摘要 为了简化传统的细胞冷冻方法 ,即用 10 %二甲基亚砜 (DMSO) 作为冷冻保护剂并用程控 降温仪 - 196 ℃液氮保存 ,研究了用 5 % DMSO ,3 %羟乙基淀粉 ( HES) 和 4 %人血白蛋白 ( HSA) 作 为冷冻保护剂 ,而不用程控降温仪直接 - 80 ℃冰箱冷冻细胞的方法 。对比了不同方法冷冻保存外 周血干细胞 ( PBSCs) 的细胞活性 、单个核细胞数 、CFU2GM 和 CD34 + 细胞回收率 。结果发现 ,简便 冷冻法可获得更高的单个核细胞 ( MNC) 和 CFU2GM 回收率 ,无凝集现象 ;并且经长达 24 个月冷 冻保存后仍可获得满意的 CFU2GM 和 CD34 + 细胞回收率 。37 ℃融冻和 20 ℃室温融冻法之间各项 指标无明显差别 ,细胞融冻后在室温下暴露于 5 % DMSO 中 1 小时 ,CFU2GM 回收率并不降低 ,而 细胞活性从 93. 2 %降至 84. 5 %。所以 ,这种简便的细胞冷冻保存法简便易行 ,可替代传统的液氮 保存法 ,对于没有程控降温仪的单位具有实用价值 ,而且还可减少病人 DMSO 输入量和毒性 。
2000 - 07 - 07 收稿 ;2001 - 06 - 29 接受
© 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
·364 ·
冷冻方法 10 % DMSO - 196 ℃液氮冷冻法 与分离采集
冷冻保护剂 DMSO 为上海试剂二厂产品 ,用 0. 2 μm 滤膜 滤过除菌 ;羟乙基淀粉 ( HES) 为天津氨基酸公司产 品 ,平均分子量为 14 万单位 ;人血白蛋白 ( HSA) 为 哈尔滨世亨生物工程药业有限公司产品 。 仪器 半自动程控降温仪为军事医学科学院仪器厂生 产 , - 80 ℃低温冰箱为日本三洋公司产品 ,流式细胞 仪 FACSCalibur 为美国 Becton Dickinson 公司的产 品。
Period of cryopreservation (mont h)
Cell viability ( %)
MNC
Recovery rate ( %) CFU2GM
CD34 + cell
1
93. 2 ±1. 4
91. 4 ±2. 1
90. 4 ±7. 4
98. 8 ±4. 8
3
91. 6 ±2. 1
的 PBSCs 等体积的含 20 % DMSO 的 RPMI 1640 培 养液 (4 ℃预冷) ,缓缓滴入 PBSCs 中 ,先慢后快 ,边滴 边摇 ,混匀后置于 5 ml 聚乙烯冷冻管 (COSTAR) 中 , 以 4 层纱布包裹 ,然后用半自动程控降温仪 ,以 1 3 ℃Π分的速度降温到 - 80 ℃,然后投入液氮中保存 。
88. 2 ±3. 0
90. 4 ±5. 2
97. 7 ±4. 5
6
89. 2 ±4. 3
86. 7 ±5. 0
82. 9 ±4. 9
93. 7 ±4. 8
12
88. 5 ±2. 8
88. 6 ±4. 4
79. 6 ±5. 0 3
91. 0 ±4. 2
24
85. 5 ±3. 9
89. 0 ±2. 8
关键词 冷冻保存 外周血干细胞 干细胞移植 中国图书资料分类法分类号 Q462
在外周血干细胞移植中 ,干细胞的冷冻保存技 术是移植成功的关键环节之一 ,尤其是自体外周血 干细胞移植 ,患者在动员和分离采集自体外周血干 细胞 (APBSCs) 后 ,需休整数日 ,更需经过大约 1 周 左右的放 、化疗预处理 。在这段时间内 ,为了保持 APBSCs的细胞活性及造血和免疫重建功能 ,细胞必 须冷冻保存 。传统的外周血干细胞 ( PBSCs) 保存方 法是用 10 %二甲基亚砜 (DMSO) 作冷冻保护剂 ,用 程控降温仪降温至 - 80 ℃后 ,立即置 - 196 ℃液氮中 保存 。此方法安全有效且保存时间长 ,但需购买昂 贵的程控降温仪及液氮装置 ,并需频繁地添加液氮 , 所以 成 本 高 , 操 作 烦 琐 , 工 作 量 大 。1983 年 Stiff 等[1] 报道非程控降温法 ,在 - 80 ℃冰箱中保存人骨 髓细胞成功之后 , Makino 等[2] 于 1991 年将此法用 于PBSCs的保存也获成功 。非程控降温 - 80 ℃保存 PBSCs 方法简便实用 ,成本低廉 ,细胞回收率和存活 率高 ,易推广普及 ,所以我们对 - 80 ℃保存 PBSCs 技术进行了研究 。
直接 - 80 ℃冷冻法与人工梯度降温 - 80 ℃冷冻 法冷冻效果的比较
5 % DMSO ,3 % HES 和 4 % HSA 作为冷冻保 护剂直接 - 80 ℃冷冻法与人工梯度降温 - 80 ℃冷冻 法冷冻 1 个月时冷冻效果的比较 ,各项指标间差异 很小 ,无统计学意义 ,见表 3 。
快速融冻与室温融冻冷冻效果的比较 5 % DMSO ,3 % HES 和 4 % HSA 作冷冻保护 剂直接 - 80 ℃冷冻法冷冻1个月 ,快速融冻 ( 37 ℃
结 果
5 % DMSO , 3 % HES 和 4 % HSA 作为联合冷
中国实验血液学杂志 J Ex p Hem atol 2001 ; 9 (4)
冻保护剂的 - 80 ℃冷冻法 , 10 % DMSO - 196 ℃液 氮冷冻法及 10 % DMSO - 80 ℃保存法的冻存效果 比较
3 种冷冻方法冷冻保存 1 个月的效果的比较见 表 1。
Table 1 Comparison of cryopreservation effects of 3 methods
Cr yop ro t ect a nt
Temprature Cell viability
ecovery rate ( %) CFU2GM
5 % DMSO + 3 % HES + 4 % HSA
材料与方法
外周血干细胞的来源及检测 我院血液科和小儿科血液系统恶性肿瘤或乳腺 癌患者 10 例 ,在完全缓解 (CR) 期经大剂量放 、化疗
后 ,造血恢复期经 G2CSF (每日 150 - 300μg) 动员 3 天后 ,用 Cobe (美国产品) 或 CS23000 plus (美国产 品) 血细胞分离机分离采集外周血造血干细胞悬液 (PBSCs) ,用 RPM I 1640 培养液 ( Gibco 产品) 调整 细胞 浓 度 至 ( 8 - 30 ) ×107Πml , 测 定 MNC 数 和 CFU2GM (用北京大学人民医院所售试剂测定) 及用 Becton Dickinson 公司的产品 CD342F ITC 免疫标记 抗体 ,直接荧光法标记 ,用流式细胞术测定 CD34 + 细胞 ,并进行冷冻 。每份标本作两管复管 ,融冻后 , 用 0. 5 %台盼蓝拒染法 ,观察细胞活性 ,并进行以上 各项测定 ,计算 MNC ,CFU2GM 和 CD34 + 细胞的回 收率 。
融冻 快速融冻法 从液氮或冰箱中取出冷冻管 ,立 即投入 37 ℃水浴中 ,并快速摇动 ,使冰晶在 1 分钟 内消失 ,立即测定台盼蓝拒染率 。部分细胞置室温 (20 ±2 ℃) 1 小时后测 MNC ,CFU2GM 和 CD34 + 细 胞 ,其余细胞在 3 分钟内用 5 倍体积的含 10 %人 “AB”血清的 RPM I 1640 培养液洗 2 遍 ,检测 MNC , CFU2GM 和 CD34 + 细胞 ,并与冻存前各项指标比 较 ,计算其回收率 。 室温融冻 从 - 80 ℃冰箱中取出冷冻管 ,置室 温 (20 ±2 ℃) ,自然融化 。测定项目同前 。
76. 1 ±6. 2 3
87. 4 ±5. 6
3 P = 0. 003 compared to 1 mont h group