金属离子对漆酶催化活性的影响

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2 .3 Fe2 +离子的抑制位点 考察了 Fe2 +对漆酶吸收光谱的影响 , 如
图5 所示 , 发现漆酶的两个特征吸收峰, 即
614 nm 和 330 nm 处的吸光度均无实质性变 化 .从外观看 , 漆酶液仍保持有蓝色 .用该酶 液进行 D DClQ H2 的催化氧化 , 看不出 Fe2+ 的抑制作用 .
首先定性地考察了在 11 种金属离子存在下底物的漆酶催化氧化反应的吸收光谱变化 .发 现只有 Fe2 +离子对反应有明显的抑制作用 , 如图 1b 所示 , 图 1a 为未加金属时底物的漆酶
图 1 在 Fe2 +存在下 , DDClQH2 漆酶催化氧化 反应的吸收光谱变化(pH =4 .40)
催化氧化反应的吸收光谱变化 , 389 nm 处的底物特征吸收峰 , 它随反应的进行而逐 渐下降 ;450 ～ 600 nm 范围出现的新峰为反应产物半醌自由基阴离子的特征吸收 , 它在一段时
取浓竹溪漆酶液 2 .0 mL , 绘制吸收光谱图 , 测定漆酶特征吸收 614 nm 和 330 nm 处的吸 光度值 .然后加入一定量 Fe2+离子 , 追踪 614 nm 和 330 nm 处吸光度随时间的变化 .一段时间
后 , 绘制吸收光谱图 .
2 . 结果与讨论
2 .1 金属离子对漆酶催化活性的影响
(① 江西省物资学校 , 南昌 330008 ;② 江西师范大学化学系 , 南昌 330027 ;③ 武汉大学化学系 , 武汉 430072)
摘 要 :以 5 , 6-二氯-2, 3-二氰基氢醌 为底物 , 在 pH =4 .40 条件 下 , 用 分光光度法 考察了 11 种
生命金属 离子(N a+ 、K +、Ca2 +、M g2 +、M n2 + 、Fe2 + 、Co2 +、Cu2 +、Cr6 +、Ni2 +、Z n2 +)存在下 的漆酶 催化 氧化反应 , 发现 Fe2 +离子对漆酶的催化活性显示出抑制作用 , 探讨了其抑制特征 、抑 制位点和作 用方 式 .结果表明 , F e2 +离子对漆酶催化活性抑制属竞争性抑制 过程 , F e2 +离子 的抑制作 用是通过还 原漆 酶反应产 物半醌自由基 阴离 子来 完成 的 .Fe2 +离子-漆 酶复 合物 的解 离常 数(K i)经测 定 为 17 .5 × 10-6 mol·L -1 .
对巯基(SH)不具有亲合力 , 它不可能对漆酶 Ⅰ 型铜部位造成影响 , 更不会触及三核铜簇 .
Cl
Cl
Fe2+ + O· Cl
○
CNO -
+H
+
Fe3
+
+
OH
Cl
○ CNO-
CN
CN
从实验结果可知 , 在 DDClQH2 浓度为 1 .26 ×10 -4 mol·L -1情况下 , 当使用 91 %抑制率的
His 、Cys 和 Met 残基中的咪唑基 、巯基和甲硫基相配位 , 构成变形正四面体的几何构型[ 5] .由
于 S ※Cu(Ⅱ)的 C T 电荷跃迁 , 漆酶在 614 nm 附近有强吸收 , 并呈蓝色 .Ⅰ型铜(Ⅱ)部位在漆
酶催化过程中发挥电子传递功能 , 起着“板机”的重要作用 .三核铜簇部位的主要功能是载氧和
用延迟加入 Fe2+离子的方 法对底物的
漆酶催化氧化反应进行了考察 .如图 6 所示 , 发现 Fe2+离子一加入 , 反应生成的对苯半醌
自由基阴离子(紫色)立刻消失 , 但等待一段 时间后 , 酶反应又重新起动 , 等待时间的长短 与 Fe2 +离子浓度有关 .
图 4 Fe2 +离子对漆酶催化活性的抑制特征 〔FeSO 4〕 ×10 -6/ mol·L -1 :0(★),
第 22 卷第 3 期 1998 年 8 月
江西师范大学学报(自然科学版) JO U RNA L OF JIA NGX I NO RMA L UN IV ERSI T Y
Vol.22 No .3 A ug 1998
生命金属离子对漆酶催化活性的影响＊
张 力① 花建丽② 王光辉③ 李先春② 汪德先②
F e2 +离子浓度(3 .21 ×10-4 mol·L -1)时 , 完成上述还原过程约需 15 min .
F e2 +离子虽然对漆酶没有作用 , 但却能迅速还原酶反应生成的半醌自由基阴离子 , 间接
〔DDClQ H2〕:1.26 ×10-4 mol·L -1
〔F eSO4〕 :3.21×10-4 mol·L -1
漆酶(Laccase .EC .1 .10 .3 .2)是含 4 个紧密结合铜(Ⅱ)的氧化酶 , 它担负电子转移和氧活
化的双重功能 , 催化二酚类底物(Q H2)的氧化 , 生成半醌自由基阴离子产物(SQ -), 分子氧经
制特征 、抑制位点和作用方式进行了探讨 .
1 实验部分
1 .1 试剂 、仪器和实验方法
漆酶的分离纯化和底物的合成如文献[ 3] 进行 , 金属离子溶液均按标准方法配制 , 为了避
免阴离子对酶反应的干扰
,
选择
NO
3Biblioteka Baidu
或
Cl
-为其共存阴离子
,
其它试剂均为
A
.R
级
,
未进一
步纯化 .
实验于 30 ±0 .1 ℃下进行 , 在 pH =4 .40 的 HOAc-NaOAc 缓冲液(以下简称缓冲液)中加
入 4 μL 漆酶液和一定量的金属离子溶液 , 在 30 ±0 .1 ℃下放置一定时间后 , 加入一定量的底
物启动反应 .用分光光度计定时追踪反应开始后几 分钟内酶反应产 物特征吸收处(λ=520
nm)吸光度随时间的变化 , 通过吸光度变化对时间作图 , 可分别求得加入金属离子前后的反应
初始速度 V 0 和 V M .
P% -1 .21 +1 .18 -0 .48
根据以上结果可知 , Fe2 +离子对酶反应有明显的抑制作用 , 但这种抑制作用是暂时性的 (图 2), 不久漆酶又能重新进行催化反应 , 且反应速度与未加 Fe2 +离子时近似 .实验还发现 , F e2 +离子浓度与抑制率呈非线性关系(图 3), 具有饱和动力学特征 .当 FeSO 4 浓度为 3 .21 ×
按 1 .1 实验条件 , 先加入 4 μL 漆酶液于缓冲液中与 Fe2+离子结合一定时间(t )后 , 再加 入一定量底物启动反应 , 求出漆酶在缓冲液中放置时间对漆酶活性的影响 .绘制 P-t 图 . 1 .5 Fe2 +离子对漆酶催化活性的抑制特征
按 1 .1 实验条件 , 在几种固定浓度的 Fe2 +离子存在下 , 测定不同底物浓度的酶促反应速 度 VM .然后绘制 V0-1-〔S〕-1图和 V -M1-〔S〕-1图 . 1 .6 Fe2 +离子对漆酶吸收光谱的影响
酶促反应的影响 .
表 1 金属离子对漆酶 催化活性的影响
金属离子
Na + K+ Ca2 + Mg2+
P%
0 .00 -0 .04 +0 .01 -0 .80
金属离子 P % 金属离子
M n2 + F e2 + Co2 + Cu2 +
+0 .03 -22 .70 -1 .38 +0 .02
Cr6 + Ni2 + Zn2 +
收稿日期 :1998 -02 -20 ＊国家自然科学基金资助课题
第3期
张 力等 生命金属离子对漆酶催化活性的影响
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所用仪器为 UV-3000 型分光光度计(日本).
1 .2 金属离子对漆酶催化活性的影响
在 pH =4 .40 条件下 , 以 1 μg 金属离子的作用百分率 P 表示该金属离子对漆酶催化活性
10-4 mol·L -1时 , 抑制率可达 91 %.
图 2 F e2 +离子抑制的时效性 〔DDClQH2〕 :1 .26×10-4 mol·L -1 〔FeSO4〕 :1 .07×10-4 mo l·L -1
图 3 Fe2 +离子浓度对抑制效应影响 〔F eSO4〕 :1.07×10-4 mol·L -1 〔DDClQ H2〕:1.26 ×10-4 mol·L -1
7 .14(△), 11 .7(□), 17 .8(○)
图 5 F e2 +离子对漆酶吸收光谱的影响
图 6 Fe2 +离子延迟加入 , 对 DDClQH2
漆酶 220 u/ mL , 2 .0 m L
酶促反应的影响
〔FeSO4〕 :— 0 ;…7 .07×10-4mol·L -1
抗磁性金属离子能提高酶反应产物邻苯半醌自由基阴离子的动力学稳定性 , 使其容易在静止 条件下有效地捕获[ 1] .为了进一步确立金属离子在漆酶催化过程中的确切作用 , 深化对漆酶 化学作用本质规律的认识 , 本文用分光光度法考察了 11 种生命金属离子[ 2] 对底物 5 , 6-二氯2 , 3-二氰基氢醌(DDClQH2)的漆酶催化氧化反应的影响 , 并就 Fe2 +离子对漆酶催化活性的抑
促进氧还原 . F e2 +离子对漆酶两个特征吸收峰 614 nm(Ⅰ 型铜)和 330 nm(三核铜簇)均无实质性影
响 , 证明 Fe2+离子对漆酶催化活性的抑制作用 , 不是通过重组漆酶 Ⅰ 型铜部位或三核铜簇部 位达到的 , 而是通过还原酶反应产物半醌自由基阴离子来完成的 , 即 Fe2 +离子的抑制位点在
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江西师范大学学报(自然科 学版)
1998 年
间内随反应的进行而迅速上升 .Fe2+离子的抑制作用表现在底物特征吸收峰的下降速度显著
变慢和 450 ～ 600 nm 范围内半醌自由基阴离子的形成和积累急剧减少 .
在此基础上 , 测定了 11 种金属离子对漆酶催化活性的作用百分率 P , 列于表 1 .表中数据 表明 , 11 种生命元素的大多数金属离子对漆酶催化活性不产生影响或影响不明显 , 而 Fe2 +离 子则具有强烈的抑制效果 .由于 F e3 +离子对底物表现出强氧化性 , 只考察了 Fe2+离子对底物
关键词 :漆树漆酶 , 生命金属离子 , 竞争性抑制作用 , 分光光度法 中图法分类号∶O623.624
对酶催化活性的研究是深入理解酶的催化机理的一条重要途径 .在以往的漆酶化学研究 中 , 发现金属离子与漆酶的催化氧化反应之间有一定的关系 , 如 Z n2+ 、Cd2 + 、Ca2+和 M g2+等
的影响程度P =(VM -V 0)/ V 0 ×100 % 1 .3 Fe2 +离子浓度对抑制效应的影响
按 1 .1 实验方法求出底物浓度为 12 .6 ×10-5 mol·L -1时的反应初始速度(V0)和在其中 加入不同含量 Fe2+离子后的反应初始速度(VM), 绘制〔F e2 +〕-P 图 . 1 .4 Fe2 +离子与酶结合时间对抑制效应的影响
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江西师范大学学报(自然科 学版)
1998 年
半醌自由基阴离子 .Fe2+离子的还原作用使半醌自由基恢复到底物状态 , 漆酶不断催化底物 生成半醌自由基 , 半醌自由基又不断被还原成底物 , 这一过程表现为抑制 ;待 Fe2 +离子全部转 变成 Fe3+离子后 , 抑制过程即告终结 , 于是酶反应又重新恢复 .显然 , Fe2 +离子不属于软酸 , 它
4-电子还原生成水[ 2] .
QH2
QH - +H + Q H - +O2 Laccase SQ - +H2O
漆酶分子所含的 4 个铜(Ⅱ)归属于 3 种类型 , 构成活性中心 , 即一个 Ⅰ型铜 , 一个 Ⅱ型铜 和一个双核 Ⅲ型铜 , Ⅱ型 铜和 Ⅲ型 铜部位又共同 组成一个三核 铜簇[ 5] .漆酶 Ⅰ 型铜(Ⅱ)与
逆抑制中的最简单类型 , 即竞争性抑制 .
利用
V
-1 o
和
V
-1 M
对[ Fe2+]
作 Dixon
图[ 4]
, 求得 Fe2+-漆酶复合物的解离常数(K i ), 在 pH
=4 .40 条件下 , K i 值为 17 .5 ×10-6 mol·L -1 .
第3期
张 力等 生命金属离子对漆酶催化活性的影响
2 .2 Fe2 +离子的抑制特征和 Fe2 +-漆酶复合物的解离常数(K i)
测定底物和 F e2 +离子在不同浓度下的酶反应初始速度 , 并以
V
-1 0
和
V
-1 M
分别对〔S〕-1
作图 , 可以判断 Fe2+ 离子的抑制特 征 .图 4 所示 , Fe2 +离子对 漆酶催化活性 的抑制不改变
Vmax , 只改变 K M , 且 K M 值依 Fe2+离子浓度的增加而增大 , 表明 F e2 +离子的抑制作用属于可