蛋白质提取与分离纯化生化实验设计讲解共16页文档
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
蛋白质的分离纯化及实验技术学习教案
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第六页，编辑于星期三：点 四十五分。
4. 等电点
等电点（pI）是蛋白质上净电荷为零时的pH 值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基 数目和滴定曲线所决定。
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第七页，编辑于星期三：点 四十五分。
5. 电荷分布 电荷的氨基酸可均匀地分布于蛋白质的 表面，亦可成簇地分布，使某一区域带 强的正电荷而另一区域带强负电荷。这 种非随机的电荷分布可用来通过离子交 换层析来分离蛋白质。
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第十三页，编辑于星期三：点 四十五分。
第二节 蛋白质分离纯化的
一般步骤
（一）前处理
பைடு நூலகம்
（二）粗分级 （三）细分级
动物材料应先剔除结缔组织和 脂肪组织； 种子材料应先去壳甚至去种 皮以免受单宁等物质的污染 ，油料种子最好先用低沸点 的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择 适当的方法，将组织和细胞 破碎。动物组织和细胞可用
胶体颗粒通过密度梯度超离心示意图
以Au 纳米颗粒的分离的效果
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第二十六页，编辑于星期三：点 四十五分。
3.凝胶层析
又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间
网状结构的物质，有天然的，
也可人工合成。根据网孔不同
可制成不同规格。
具备条件：1惰性，2水不溶性， 3能高度水化。
常用分子筛：
gradien滴t加样）品
离 心 管
蔗糖浓度
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蔗糖密度梯度
第二十四页，编辑于星期三：点 四十五分。
密度梯度离心
滴加样品
塑料离心管
分
4%
子 量
8%
由 小
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质分离纯化技术PPT课件
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带 电荷不同进行分离的。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电 荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的 pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的 蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交 换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中 的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
第5页/从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离 了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受 到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各 步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。
在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存 在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。
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蛋白质的抽提
一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来，再 用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓冲溶 液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。
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蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方 法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
蛋白质分离与纯化技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生 命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的 物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化 出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能 需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业 中的核心技术。
第一章蛋白质的分离与纯化课件
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反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活 ，故适用于提取非常稳定的蛋白质
冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用 于从细菌或病毒中提取蛋白质
低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗 透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解
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❖ 化学法
有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)
可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性 的渗透出来
表面活性剂(去垢剂)：常用的有十二烷基磺酸 钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等
酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选 择适当的酶
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❖ 特异、快速、精确、可重复、经济 ❖ 总蛋白含量 ❖ 蛋白质比活性（specific activity） ❖ 得率
❖ 还原剂
❖ 去垢剂 (detergent) ❖ 蛋白酶抑制剂 ❖ 蛋白质的环境因素
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第二节 层析的基本理论
1906年 M.Tswett Adsorption Chromatography 1941年 Martin and Synge Partition Chromatography
因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽
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一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？
➢ Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米
➢ Verzele计算为0.02厘米
➢ 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，
在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。
匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一 组织捣碎：注意维持低温环境
蛋白质的分离纯化讲解
①从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现 象的本质有重大意义。
②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等 工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉 酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。
③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 ④基因工程的需要
特点
在 pH<8.6 应用
阴离子 DEAE—
常用的离子交换纤维素
的生物亲和力
1、粗分级分离
▪ 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶 剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量 的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、 处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩 蛋白质，但分辨率低。
（1）盐析
向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称 为盐析。
(NH4)2SO4
血清
50%饱和度
球蛋白
析出
清蛋白
100%饱和 析出
（2）等电点沉淀
蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数 量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值 等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节 溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而 与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。
第四节 蛋白质的层析分离
应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。 由于待分离的各种物质在这两个相分配系数不 同，当两个相作相对运动时，这些物质在两相 间反复多次分配，结果使其相互分开。
根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和 液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分 配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和 层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、 纸层析等。
蛋白质分离纯化技术实验讲义
实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。
二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。
此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。
2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。
四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml 无水乙醇后，再加入100 ml 85%的磷酸，加MiliQ水定容至1 L，过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
蛋白质分离纯化技术实验讲义
蛋⽩质分离纯化技术实验讲义实验⼀蛋⽩质含量分析（Bradford检测法）⼀、实验⽬的1、制作蛋⽩质浓度标准曲线；2、测定未知蛋⽩质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋⽩质的浓度。
⼆、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋⽩质浓度是1976年由Bradford建⽴的，是最常⽤的蛋⽩质快速定量⽅法。
该⽅法根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红⾊，最⼤光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋⽩质结合后变为青⾊，蛋⽩质-染料结合物在595nm波长下有最⼤光吸收，且光吸收值与蛋⽩质含量成正⽐，因此可⽤于蛋⽩质含量的定量测定。
蛋⽩质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应⼗分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：灵敏度⾼；测定快速、简便，只需加⼀种试剂；⼲扰物质少。
此法的缺点是：仍有⼀些物质⼲扰此法的测定，主要的⼲扰物有去污剂、Triton X-100、SDS 和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml ⽜⾎清蛋⽩（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；⽆⽔⼄醇；85%磷酸；MiliQ⽔。
2、器材：滤纸；烧杯；漏⽃；可见分光光度计；试管。
四、实验⽅法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml ⽆⽔⼄醇后，再加⼊100 ml 85%的磷酸，加MiliQ⽔定容⾄1 L，过滤备⽤。
2、标准蛋⽩溶液的稀释取10⽀试管，按表中顺序排列，分别加⼊考马斯亮蓝溶液、⽔和样品。
每加完⼀管，⽴即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产⽣⼤量⽓泡⽽难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可⽤⽐⾊⽫，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：不可使⽤⽯英⽐⾊⽫（因不易洗去染⾊），可⽤塑料或玻璃⽐⾊⽫，使⽤后⽴即⽤少量95%的⼄醇冲洗，塑料⽐⾊⽫不可⽤⼄醇或丙酮长时间浸泡。