基因诊断和基因治疗分子生物学课件
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分子生物讲义：第五章 基因诊断和基因治疗
第五章 基因诊断和基因治疗
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
第十四章基因诊断和基因治疗GenediagnosisandGene.ppt
连锁分析是基于遗传标记与Gene连锁，子 代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。
这些遗传标记是基因组中的DAN 多态，如：
RFLP，VNTR 等。
2020-11-9
谢谢欣赏
13
1、Gene异常不明确的遗传病的诊断
例：成年型多囊肾病——APKD，AD ，临床表 现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性 肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒 症。
14kb 10kb
正常 缺1
缺2
2020-11-9
谢谢欣赏
缺3 缺4
5
2）DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养 不良或假肥大型）
DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症 状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症 状与DMD相似，但症状较轻。
Gene 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 个 Exon ，cDNA全长13974bp 编码3685 Aa， 分子量427kD。
例 如： 镰形细胞贫血的Gene诊断 已知突变基因编码β珠蛋白链的
第6位密码子 GAG——GTG 谷Aa——缬Aa
2020-11-9
谢谢欣赏
8
1）RFLP诊断
已知限制酶MstII
识别序列
MstII 1.15kb
CCTG AGG
1.35kb x
probe
CCTGTGG 突变后不能识别， 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。
2020-11-9
谢谢欣赏
2
一、直接诊断
直接检测致病基因本身的异常。通 常使用基因本身或邻近的DNA序列作为 探针，或通过PCR 扩增产物，以检测基 因点突变、缺失、插入等异常及性质。 它主要适用于已知基因异常疾病
的诊断。
12基因诊断与基因治疗-课件1
的功能 • 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的
表达 • 基因封闭：封闭特定基因的表达
小结
• 基本概念ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基因诊断 PCR技术 基因芯片
• 基本理论 • 基因诊断过程 • 基因诊断及基因芯片的应用 • 基因治疗的过程 • 基因治疗的机理
基因治疗
基因诊断与基因治疗
回顾：
1。细胞内决定生物性状的物质是什么？其功能 单位是什么？
2。不同的基因结构上的差异表现在哪些方面？ 3。什么碱基互补配对原则？ 4。现有某DNA片断上一条链上的碱基排列顺序
是AAGGCGTTA，你能写出另一条链上碱基 的排列顺序吗？
基因诊断
基因 蛋白质 性状
基因 诊断
生化 诊断
临床 诊断
基因芯片
• 阅读课本，思考： – 什么是基因芯片？ – 基因芯片与基因诊断有什么关系？ – 基因芯片有什么优点？ – 基因芯片有哪些应用？
基因治疗
1。基因治疗： 将特定外源基因导入有基因缺陷的细
胞来治疗疾病 2。基因治疗过程： 选择治疗基因 治疗基因与载体结合
治疗基因正常表达
科目一考试网 kmyks/ 科目一模拟考试2019 金手指驾校网 jszjx/ 金手指驾驶员考试2019
基因治疗对癌症的治疗方案
• 抑制癌细胞增生基因 导入癌细胞
• 抑制癌细胞转录 DNA片断导入癌细胞
阻断癌 细胞繁 殖
• 提高机体免疫力基因 导入免疫系统
提高免 疫力
基因治疗的机理
• 基因置换：正常基因取代致病基因 • 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 • 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因
表达 • 基因封闭：封闭特定基因的表达
小结
• 基本概念ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基因诊断 PCR技术 基因芯片
• 基本理论 • 基因诊断过程 • 基因诊断及基因芯片的应用 • 基因治疗的过程 • 基因治疗的机理
基因治疗
基因诊断与基因治疗
回顾：
1。细胞内决定生物性状的物质是什么？其功能 单位是什么？
2。不同的基因结构上的差异表现在哪些方面？ 3。什么碱基互补配对原则？ 4。现有某DNA片断上一条链上的碱基排列顺序
是AAGGCGTTA，你能写出另一条链上碱基 的排列顺序吗？
基因诊断
基因 蛋白质 性状
基因 诊断
生化 诊断
临床 诊断
基因芯片
• 阅读课本，思考： – 什么是基因芯片？ – 基因芯片与基因诊断有什么关系？ – 基因芯片有什么优点？ – 基因芯片有哪些应用？
基因治疗
1。基因治疗： 将特定外源基因导入有基因缺陷的细
胞来治疗疾病 2。基因治疗过程： 选择治疗基因 治疗基因与载体结合
治疗基因正常表达
科目一考试网 kmyks/ 科目一模拟考试2019 金手指驾校网 jszjx/ 金手指驾驶员考试2019
基因治疗对癌症的治疗方案
• 抑制癌细胞增生基因 导入癌细胞
• 抑制癌细胞转录 DNA片断导入癌细胞
阻断癌 细胞繁 殖
• 提高机体免疫力基因 导入免疫系统
提高免 疫力
基因治疗的机理
• 基因置换：正常基因取代致病基因 • 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 • 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因
基因诊断与基因治疗培训课件
6
本文档所利提供用的核信酸息仅双当供链之参处考的，之碱请用基联，系不互能本补作人为或、科网变学站性依删据除和，。复请勿性模的仿原。文理档，如有不 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待
测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同
源核酸序列的存在。
核酸探针
是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列。
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
14
本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不
（5）夹心杂当之交处法，请（联系sa本nw人i或ch网h站y删br除id。ization）
RE
RE
A
B
A
B
固
片段B捕捉探针
相 支
A
B
持 物
片断A 检测探针
本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确15 。
本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不
（6）原位杂交当之（处n，u请cl联ei系c 本ac人id或h网y站br删id除iz。ation in situ）
将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA或RNA序列。
三. 基当之因处，诊请联断系本人常或网用站删技除。术方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序
4
本（文档一所提）供核的信酸息分仅供子参考杂之交用，技不术能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不 当之处，请联系本人或网站删除。 核酸分子杂交
是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下， 与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。
第21章基因诊断与基因治疗.pptx
目录
目录
基因芯片的应用
1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找
新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用
药物筛选、药物作用机制研究、耐药 菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化 学毒物的筛选、基因扫描等
目录
（五）、DNA指纹(DNA fingerprint)
在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星” 区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限 制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不 同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同 个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同， 如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因 此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹 （genetic fingerprint）。
tandem repeat）
目录
单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱 基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能 形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯 酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。
目录
PCR-SSCP分析
常规PCR、巢式PCR、多重 PCR、多种PCR、不对称PCR、反 转录PCR、定量反转录PCR、 mRNA差异显示PCR、原位PCR、 实时PCR等等。
目录
3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法
PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR（短串联重复序列，short
第二十一章
基因诊断与基因治疗
Genetic Diagnosis and Gene Therapy
目录
基因(gene)
基因是为生物活性产物编码的 DNA功能片断，这些产物主要是蛋 白质或各种RNA。
目录
基因芯片的应用
1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找
新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用
药物筛选、药物作用机制研究、耐药 菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化 学毒物的筛选、基因扫描等
目录
（五）、DNA指纹(DNA fingerprint)
在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星” 区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限 制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不 同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同 个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同， 如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因 此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹 （genetic fingerprint）。
tandem repeat）
目录
单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱 基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能 形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯 酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。
目录
PCR-SSCP分析
常规PCR、巢式PCR、多重 PCR、多种PCR、不对称PCR、反 转录PCR、定量反转录PCR、 mRNA差异显示PCR、原位PCR、 实时PCR等等。
目录
3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法
PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR（短串联重复序列，short
第二十一章
基因诊断与基因治疗
Genetic Diagnosis and Gene Therapy
目录
基因(gene)
基因是为生物活性产物编码的 DNA功能片断，这些产物主要是蛋 白质或各种RNA。
基因诊断和基因治疗演示课件
急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以Nras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。
2. ras原癌基因突变常用的检测方法
PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第12位密码
子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接
测序确定患者ras原癌基因的点突变。
核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位
基因诊断中常用的分子生物学方法比较
方法
优点与问题
解决方案
核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐
选择合适的探针
PCR
灵敏度、特异性高
设计合适的引物
SSCP
操作简便、检出率不高
选择合适的片段
RFLP
结果可靠但限制较多
选择合适的限制酶
DNA测序 生物芯片
可自动化，但不适宜广泛使 用
效率高，成本高，不适宜广 泛使用
2、外来生物的入侵
基因诊断的特点：
1.特异性高，针对性强： 使用基因探针通过分子杂交 进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊 断或发病原因分析。
2. 灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂标 记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有很高的 灵敏度。
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
差异
四、基因诊断中常用的分子生物学技术
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断
2. ras原癌基因突变常用的检测方法
PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第12位密码
子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接
测序确定患者ras原癌基因的点突变。
核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位
基因诊断中常用的分子生物学方法比较
方法
优点与问题
解决方案
核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐
选择合适的探针
PCR
灵敏度、特异性高
设计合适的引物
SSCP
操作简便、检出率不高
选择合适的片段
RFLP
结果可靠但限制较多
选择合适的限制酶
DNA测序 生物芯片
可自动化，但不适宜广泛使 用
效率高，成本高，不适宜广 泛使用
2、外来生物的入侵
基因诊断的特点：
1.特异性高，针对性强： 使用基因探针通过分子杂交 进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊 断或发病原因分析。
2. 灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂标 记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有很高的 灵敏度。
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
差异
四、基因诊断中常用的分子生物学技术
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断
基因诊断与基因治疗3.ppt
胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带
传染病的基因诊断
Gene Diagnosis of Infectious Diseases
一、病毒性疾病
• 甲型肝炎病毒（HAV）
HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出 甲型肝炎病毒的基因组RNA。
• 乙型肝炎病毒（HBV）
腺病毒的优点
基因导入效率高，对人类安全； 宿主范围广； 基因转导与细胞分裂无关； 腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。
腺病毒载体缺点
不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增 殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂 而丢失的机会增多，表达时间相对较短。
宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。
12位密码子点突变。
3．抑癌基因p53的检测
• p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、 第273位及 第282位点突变率最高。在结直肠 癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53 基因蛋白。
• p53的基因诊断方法有
（1）PCR-SSCP分析技术 （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP分析
PCR-SSCP分析原理示意
限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的 酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化 时产生不同长度或不同数量的片段。
可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。
• 幽门螺杆菌（HP）
主要采用PCR技术：①检测HP染色体DNA 特 异 片 段 ； ② 检 测 HP 尿 素 酶 A 基 因 ； ③ 用 PCR-RFLP鉴别HP菌株。
传染病的基因诊断
Gene Diagnosis of Infectious Diseases
一、病毒性疾病
• 甲型肝炎病毒（HAV）
HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出 甲型肝炎病毒的基因组RNA。
• 乙型肝炎病毒（HBV）
腺病毒的优点
基因导入效率高，对人类安全； 宿主范围广； 基因转导与细胞分裂无关； 腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。
腺病毒载体缺点
不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增 殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂 而丢失的机会增多，表达时间相对较短。
宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。
12位密码子点突变。
3．抑癌基因p53的检测
• p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、 第273位及 第282位点突变率最高。在结直肠 癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53 基因蛋白。
• p53的基因诊断方法有
（1）PCR-SSCP分析技术 （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP分析
PCR-SSCP分析原理示意
限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的 酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化 时产生不同长度或不同数量的片段。
可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。
• 幽门螺杆菌（HP）
主要采用PCR技术：①检测HP染色体DNA 特 异 片 段 ； ② 检 测 HP 尿 素 酶 A 基 因 ； ③ 用 PCR-RFLP鉴别HP菌株。
《生物化学》教学课件：基因诊断与基因治疗-1-8
（一）核酸分子杂交
按碱基互补原则, 利用标记的探针进行配对, 形 成杂合双链的过程。
核酸分子杂交流程
待测核酸制备 滤膜上核酸固化
杂交 去除未杂交的探针
核酸探针制备 探针标记
加入标记探针
检测杂交信号
1. Southern 印迹杂交
提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产 生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处 理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标 记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信 号。
E
－
＋
FG
C +D E F
B A G
（五） DNA序列测定（DNA sequencing）
DNA序列自动分析
橙 ddG 绿 ddA 红
蓝 ddC
ddT
不同荧光素标记
DNA合成
毛细管电泳
32
测序结果展示
序列分析用于基因诊断研究 左侧：正常；右侧突变
（六）生物芯片（biochips）
• 基因芯片（gene chip） • 蛋白质芯片(protein chip)
基因芯片杂交流程示意图
基因诊断中常用的分子生物学方法比较
方法
优点与问题
解决方案
核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐
选择合适的探针
PCR
灵敏度、特异性高
设计合适的引物
SSCP
操作简便、检出率不高
PCR-SSCP分析原理示意
PCR-SSCP分析
-
+
正常人
纯合突变 杂切位点或原有的酶切 位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同 长度或不同数量的片段，称限制性片段长度多态性 分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 。
基因诊断与基因治疗PPT课件
40’’～1分
100bp/1分
2019/11/10
32
（1）DNA模板的变性
将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ）， 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入
2019/11/10
28
2019/11/10
荧 光 原 位 杂 交
9 29
2019/11/10
荧 光 原 位 杂 交
10 30
2、聚合酶链反应（PCR)
一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。 （无细胞分子克隆技术）。
原理：
以待扩增DNA为模板，在互补模板两端序列的寡核 苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下， 按半保留复制机制沿模板链延伸，快速、特异地扩 增特定的DNA。
11
基因诊断的基本策略：
1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因
这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位 在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改 变亦较清楚。
如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、 与致病有关的癌基因、抗癌基因、
地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。
2019/11/10
pH8.38.88 偏 碱 缓 冲 液 ； 并 含 有 一 定 量 的
Mg2+浓度；
（5）dNTP浓度
PCR 一 般 用 50200μmol/L 的 dNTP ； 并 且 4 种 dNTP浓度应相等；
2019/11/10
39
（6）参数
① 变性温度与时间
一般选择： 940C， 30秒
相关主题
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五.基因诊断的应用及意义
1. 遗传性疾病的基因诊断 2. 肿瘤的基因诊断 3. 传染病的基因诊断 4. 个体识别和物证分析
五.基因诊断的应用及意义
1. 遗传性疾病的基因诊断
➢ 辅助遗传病的临床诊断 单基因遗传病的基因诊断 ：已不存在任何技术障碍 产前诊断：高危人群，优生优育
1.1k b
五.基因诊断的应用及意义
四.基因诊断的常用技术方法
3. 核酸序列分析技术
正常对照
患儿
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变
最直接、最确切的基因诊断方法
四.基因诊断的常用技术方法
4. 限制性酶谱分析技术
H
M
N
最经典的基因诊断方法
பைடு நூலகம்
四.基因诊断的常用技术方法
5. 基因芯片
多基因多位点，基因表达分析，药物敏感分析 基因芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术
一.基因诊断的基本概念和特点
目标疾病：与基因有关 内源性基因变异疾病（先天/后天）
单基因病 多基因病
获得性基因病
外源性基因（如病毒等）侵入机体引起的疾病
一.基因诊断的基本概念和特点
特点 针对性强：特定基因 特异性高：针对序列的定性定量 灵敏度高：实现单分子诊断 稳定性高：遗传物质的稳定性，相对于表型 应用范围广：早期诊断，全程诊断
FISH
FISH荧光染色体原位杂交应用最为广泛
四.基因N诊C膜断的常用技术方法
点杂交Dot hybridization
探针
野生型 突变型
A
T
C
G
探针杂交
正常人
突变纯合子
突变杂合子
四.基因诊断的常用技术方法
2.PCR及相关技术
四.基因诊断的常用技术方法
2.PCR及相关技术
正常人
患者
扩 增
电 泳
一.基因诊断的基本概念和特点
临床诊断
生化诊断
表 型
分
析
免疫诊断
一.基因诊断的基本概念和特点
DNA确定为遗传物质
1976年加州大学华裔科学家 简悦威用核酸分子杂交首次 对α珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断
人类基因组计划 人类单体型计划 千人基因组计划
疾病与基因的关系愈加明晰，基因诊断进入快速发展期
一.基因诊断的基本概念和特点
实现基因诊断的要素 疾病或个体表型的本质明确 遵循生物遗传学基本规律 分子生物学技术与方法可靠完备
二.基因诊断的基本策略和内容
基本策略
致病基因检测
基因表达 定量分析
基因诊断策略
表型克隆 基因分析
连锁遗传标志检测
二.基因诊断的基本策略和内容
基本内容 1.检测个体的基因序列的特征(多态性）
基因诊断
Gene Diagnosis
生物化学与分子生物学教研室 河南省生物精神病学重点实验室
李文强
一.基因诊断的基本概念和特点
一.基因诊断的基本概念和特点
25%的生理缺陷、30%的儿童死亡都是由遗传病引起，基因与人类 健康的关系如此紧密，实现基因诊断成为现代医学必然需求
主要内容
一．基因诊断的基本概念和特点 二．基因诊断的内容和基本策略 三．基因诊断的基本步骤 四．基因诊断的常用技术方法 五．基因诊断的应用及意义
一.基因诊断的基本概念和特点
狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交 、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特 定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾 病作出诊断。
广义：应用于DNA指纹分析、个体识别、亲子鉴别等 司法鉴定，动植物检疫以及转基因动植物中阳性基因 的检测等方面。
镰刀状红细胞贫血:β－珠蛋白基因的第六个密码子A→T,表达产物 ：谷氨酸→缬氨酸
2.基因突变分析（碱基插入，缺失，倒位等）
杜氏肌营养不良：DMD基因突变以缺失
二.基因诊断的基本策略和内容
基本内容 3.基因表达产物分析
对mRNA进行分析（AFP）
4.检测是否存在外源基因
感染性疾病
5.基因连锁分析
存在遗传标记的疾病
三.基因诊断的基本步骤
1. 获得待检样品 2. 分离纯化DNA或RNA 3. 选择合适的技术手段 4. 基因检测分析
技术上已无任何障碍，继续向简便化、高通量、低成本努力
四.基因诊断的常用技术方法
1. 核酸分子杂交 2. PCR及相关技术 3. 核酸序列分析技术 4. 限制性酶谱分析技术 5. 基因芯片
核酸分子杂交和PCR是基因诊断的基本技术
四.基因诊断的常用技术方法
1. 核酸分子杂交
Southern blot Northern blot Dot hybridization Reverse dot hybridization FISH: fluorescence in situ hybridization
镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变
PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG
1.1 kb
正常基因
1.3kb
突变基因
1.3kb
1.1k b
0.2kb
1
2
3
1、正常人 2、突变携带者 3、患者
五.基因诊断的应用及意义
1. 遗传性疾病的基因诊断
四.基因诊断的常用技术方法
1. 核酸分子杂交
是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条 互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 碱基互补：
DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C 变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链
学会选择 懂得放弃 愿意奋斗 知道感恩
二代基因测序技术用于临床诊断
2011，临床研究性应用 无创产前基因检测 癌症及其他疾病风险的基因检测 神话般的“基因体检” 国内基因测序诊断产品无一经过
医疗器械审批注册
二、自本通知发布之日起，包括产前基因检测在内的所有医疗技术需 要应用的检测仪器、诊断试剂和相关医用软件等产品，如用于疾病的预 防、诊断、监护、治疗监测、健康状态评价和遗传性疾病的预测，需经 食品药品监管部门审批注册，并经卫生计生行政部门批准技术准入方可 应用。已经应用的，必须立即停止。
四.基因诊断的常用技术方法
1. 核酸分子杂交
利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序 列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配 对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。
四.基因诊断的常用技术方法
Southern blot是早期基因诊断的主力
四.基因诊断的常用技术方法