提取质粒实验学习整理

1.菌液OD值越高，质粒产量越高

2.大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗？？？还要看质粒纯度，纯度一般

在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染

3.一般而言gene导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。

4.用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意，

从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑：

1..确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。

2.关于试剂。溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。溶液3

中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。

3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液

2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。

请严格按说明书操作。

如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！

5.Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。不过出现问题基本如下：

1。如果是质粒超纯试剂盒，得率偏低，因为Qiagen自己得专利树脂填料，对纯度得要求比对得率得要求高，在超纯质粒的抽提过程中，得率比同类产品要低些，不过OD 得比值很好，就是纯度很高。

2。如果是质粒小提，快速提取等，基本不出什么问题。

有些操作要注意，

1。Solution2,3有没有沉淀。

2。细菌培养过程中，有没有抗生素选择压力，不然质粒丢失。

4。收获细菌有没有测OD值，有些仅凭目测，呵呵，又差异得。

不过，有个建议，质粒小提，快速提取，就不要用Qiagen得了，偏贵。

6.从你跑的电泳来看，你的质粒不是很多，差不多就是300ng,可能你的小片段太少，所

以你的小片断那就看不出来了，不知道你大片段分子是小片段的多少倍，一般跑电泳能看到在50ng左右,标准的MARK是每条带是50ng,如果你即使切下来了，但你的小片段太小，也是什么都看不到的，这里有一个大约估计量的公式，小片段的纳克数等于大片段纳克数乘他们分子量的比值

7.提取质粒失败的可能的原因：1：克隆有问题；2：提质粒时裂解时间过长；3：质粒提

取试剂盒的溶液有问题；4：有点可能本身拷贝数就比较低，可换感受态重新转化后提质粒

8.做重组质粒转化大肠杆菌，质粒用的pGL3-Basic(长度4818bp),连接的目的片段为1.8kb，通过抗

性平板筛选每次都有几个单菌落长出，挑单菌落于LB培养基扩增，之后摇菌提取质粒想做酶切验证是都阳性克隆，但是提取到的质粒具有多个条带，这样的话也就没法做酶切验证了。如图前五个孔为同一平板上的五个单菌落提出的质粒，最后孔为1KB marker。请大家帮忙分析是什么原因，难道是污染？

不要跑质粒，因为质粒有开环，半开环，螺旋的，跑出来的条带大小不一样，你先以重组载体作为模板，做PCR，如果有，再做双酶切，跑质粒的话由于质粒的形态不一致就会跑出多个条带，一定要把质粒变成线性的跑才能验证。验证重组载体是否构建成功包括PCR，双酶切和测序，希望能够帮到你。

9.一般marker的DNA是线性的DNA分子。

从Ecoli中直接提出来的质粒，一般直接电泳会出现所谓的超螺旋的，线性的，双环断开的。所以在这一步，我是直接拿出测序了。但是我在之前都会再确认下。

你可以在提质粒时，先进行下菌液PCR，确定为阳性的克隆再质粒

10.冻存的菌最好拿出来以后先在抗性平板上划线复苏一下然后再挑去单菌落培养提取质粒DNA

11.我一般都是50ml离心管加15ml培养基，菌液先活化2小时再接种1:100的比例接，

然后培养14个小时吧，第二天用试剂盒提质粒，一般都能提出来，你的提不出来是不是传代次数太多，时间久了质粒丢失，之前有没有保存好的质粒，重新转化一次试试

12.质粒怎么都能提出来的吧，只是是不是你的目的质粒而已，但是每个人操作方法也不

同，我觉得你可以一步一步排除原因，首先是你的菌液，先鉴定一下，pcr什么的，确保菌是正确的，然后是摇菌，我们一般认为大肠的生长期为12—16h，所以12小时不算长，也可以参考od值，第三就是用试剂盒的操作步骤和方法了

13.提质粒的话我们都是摇将近12个小时的，这应该不是提不出来的原因~如果培养时加

抗生素了，保证长出来的菌是转化子，提不出来可能是由于质粒的拷贝数太低~之前我们做谷棒就是这样，一直提不出来，后来才知道是拷贝数只有不到5，根本就提不出来

14.环状质粒在完整的超螺旋状态下比线性的迁移快，但是如果有nick，会比线性迁移慢，

慢多少和胶浓度有关。

15.质粒：超螺旋形式跑得最快，其次是完全线性化的质粒，再就是开环形式，其中完全

线性化后才是质粒真正的大小

。提取之后质粒一般有两个条带。操作粗鲁的话可能有三条。

16.重组质粒第一步需要鉴定出正确克隆，然后过夜培养提质粒，你提质粒的菌液OD值

应该为2——4。另外你现在选的感受态转化效率没有全是金的T1转化效率高，不行可以换它。测序确认你的目的条带

17.提质粒前要先做菌落PCR或菌液PCR，正确以后再提质粒，提完以后再做酶切鉴定然

后送测序。同时你的片段只有110bp应该特别好连，检查你的酶切位点是否正确，载体有没有问题。

提质粒时一般如果在加入solutionII的时候不拉丝就不用往下提了

18.正常情况下，质粒是环状的。你提取时，试剂及外力，会对它破坏作用。所以提取出

来的质粒，会有环状、开环、线状，三种状态。而每次提取时，这三种状态的比例，是不断变化的。所以一般都用单酶、或双酶切作进一步的鉴定。当然，也有用快而经济的PCR方法来鉴定，这种方法有假阳性的可能。

19.之前从别的老师那接了JM109，我所需要的目的基因在其质粒上（Amp抗性），经摇

菌并用20%甘油保存、试剂盒提取、1%琼脂糖凝胶电泳显示单一条带（约2500bp），目的基因能扩增出来。但是过了近一个月，我再用之前保存的甘油菌划线、摇菌、试剂盒提取质粒、1%琼脂糖凝胶电泳显示单一条带（近6000bp）。那么问题来了，同一株菌种提取得到的质粒大小竟然不一样，我又做了几次重复，提取出来的质粒大小都是近6000bp，都能扩增出来我所需要的目的基因！我不知道这是什么原因造成的？

可能是两个质粒重组了，这事我也遇到过，用酶切一下再看就好了

20.1.如果连入外源基因，不大可能2500bp，一般来说；。puc18算是很小的了，也有

2.7kb，所以你第一看到的是超螺旋状态，至于大小，肯定比2500大。

2.一般我们提取质粒，看到的是超螺旋的，如果放置时间过长，也可能产生，解螺旋

的，也就是好开环的，电泳速度低，但基本不会全部变成解螺旋的。

两次看到的大小不同，个人感觉不大可能是因为构想导致，可能是质粒在大肠杆菌体内形成了二聚体，但这种情况，只是听说过，没有见过。

先进行单酶切看看。

21.我提取质粒一般只用了试剂盒里面的前三种溶液（任何试剂盒都有三种溶液，要么是

solution I，solution II和solution III，或者Buffer P1，Buffer P2和Buffer P3等等啦，当然这三种溶液可以自己配，本人嫌麻烦就是用的试剂盒里面的），后面的就是嫁接的碱法提取法，从来不用带的柱子，一般3mL菌液提取的质粒大概是

2000ng/uL*50uL左右，取1uL电泳检测效果蛮好，后续酶切转染稀释一下用，效果挺好的！

22.可以将洗脱液加热，再过柱子，可过两次增加洗脱效率。还有注意裂解菌时是否都悬

浮起来

23.我一般是5-6ml菌液，用35-45ul水洗脱。正常情况下400ng/ul*40ul