细胞培养技术

细胞培养技术
指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。

定义
培养物是单个细胞或细胞群。

细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。

在现代医学和生物科学研究中应用广泛
优点
1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。

用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究.
2.直接观察细胞的变化可便于摄影。

3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。

4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。

5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。

6.易于施用物理、化学生物的实验研究。

7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。

8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。

缺点
组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。

因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。

细胞类型
细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型
细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。

贴附型细胞的分型
1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层
特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。

细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。

起源：细胞来自中胚层间充质组织。

除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。

注意：细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称,与体内细胞不同。

2.上皮型细胞(epithlium cell type) 来自外胚层特点：扁平不规则多角型、圆形核、细胞紧密相连成细胞增殖数目增多时,整个上皮膜随之移动。

边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“ 拉网”现象与起源内外胚层组织有关。

组织: 皮肤表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。

3. 游走型细胞(wandering cell type)
特点：在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则, 密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。

4. 多形型细胞(polymorphic cell type)
特点：无规律的形态，如神经细胞。

悬浮型细胞(suspended cell type)
特点：不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间的生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。

S180肉瘤、血液里的白细胞、K562、HL－60。

分型的目的：
方便描述细胞在培养过程中的形态变化。

培养条件好时，细胞相对稳定，可反映出起源、正常异常的区别，作为判定细胞生物学性状指标。

强调：一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。

如：反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。

细胞在接种时呈三角型状态，经培养一定时间后，细胞在传代前已形成上皮型细胞。

细胞生长与增殖
培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器，生存空间及营养是有限的。

当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为“ 传代”(passage或subculture)。

值得注意的是：每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响
细胞生命期(life span of culture cells)
指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。

一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。

如：二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生命，细胞便开始凋亡(apoptosis)。

细胞在生存过程中经历以下三个阶段
1.原代培养期(primary culture)
组织到第一次传代时间大约为1～4周
特点：
细胞活跃移动,分裂,但不旺盛多呈二倍体核型。

原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。

各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明细胞独立生存性差。

2.传代期(passage)
初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)
特点：
细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploid cell line)为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。

一般细胞在10代以内冻存。

冻存配方：
向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

存于在液氮中温度可达到－196℃，可长期储存。

如解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞性状不受影响，成为保存细胞最主要的手段。

3.衰退期
特点：细胞仍生存增殖减慢不增殖轮廓增强衰退凋亡
注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期）在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneous transformation);
细胞可能获得永生性(immortality) 或称为恶性性(malignancy)。

细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuous cell line)。

而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。

培养细胞一代生存期
“ 一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。

与细胞倍增一代不是一个含义。

在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段：
1. 潜伏期(latent phase) ：
接种经过悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形) 贴壁。

初代培养细胞经过 10～24小时或更多时间。

连续细胞系和癌细胞系经过 10～30分钟贴附。

贴附现象是一个非常复杂和受多种因素的影响。

影响细胞贴附：底物表面不干净，影响细胞贴附。

利于细胞贴附：底物表面带有阳性物质与特殊物质:
纤粘连蛋白(fibronectin FN)、
细胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)
这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。

潜伏期特点：
长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。

(1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。

少见分裂相，细胞有运动活动。

(2)初代培养细胞潜伏期约为24～96小时或更长，
连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6～24小时。

(3)细胞接种密度大潜伏期短。

(4)细胞出现分裂相增多时，标志细胞进入指数增生期。

2．指数增生期(logarithmic growth phase)：
特点：细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多。

细胞分裂指数(mitotie index MI) ：
表示每1000个细胞中的分裂相数。

条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。

细胞分裂指数：
初代细胞：在0.1％～0.5％之间％,
连续分裂细胞和肿瘤细胞：3 ～5％。

指数增生期是作为细胞一代活力最好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。

指数增生期持续3～5天，细胞数量增多后生长空间变小，细胞相互接触可连接成片。

正常细胞：细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。

肿瘤细胞：没有这种现象，可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。

当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使细胞发生堆积(piled up)。

由于细胞不断增殖分裂，细胞数量持续增多，培养液的营养成分减少，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞分裂停止。

3.停滞期(stagnate phase)
细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。

表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平，也称为平顶期(plateau）。

特点：细胞不增殖,有代谢活动。

培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。

注意：
传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传 1～2代 ,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。

待细胞全部恢复后再用。

在这一点上要特别注意。