第二章_紫外可见分光光度法
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2.紫外可见分光光度法
一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光
度与溶液浓度和厚度的乘积成正比。
21
（2）表达形式 （Ⅰ）
A = lg
I0 I
= abc
式中， A： 吸光度 , 反映了溶液对光的吸收程度，为
无因次量 ；
b：液层厚度(吸收光程长度)，单位为 cm ；
c：溶液的浓度，单位 g · L-１ ；
a：吸光系数，单位
答对了！
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43
课堂练习
7.常用作光度计中获得单色光的组件是 （ ）
A.光栅(或棱镜)+反射镜 C.光栅(或棱镜)+稳压器 B.光栅(或棱镜)+狭缝
D.光栅(或棱镜)+准直镜
很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
答对了！
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44
课堂练习
8. 某药物的摩尔吸光系数（）很大，则表 明（ ）
答对了！
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39
课堂练习
3.常见紫外-可见发光光度计的波长范围为 （ ）
B. 400～760 nm
A. 200～400 nm C. 200～760 nm 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
D. 400～1000 nm
答对了！
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40
课堂练习
4. 在分光光度法中，运用朗伯－比尔定 律进行定量分析采用的入射光为（ ）
A.白光 C.可见光 B.单色光
D.紫外光
很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
答对了！
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41
课堂练习
5. 符合朗伯-比尔定律的有色溶液稀释 时，其最大吸收峰的波长位置 （ ）
紫外-可见分光光度法-N讲解
2.红移与蓝(紫)移 化合物结构及溶剂改变等，使吸收峰向长波长方向移动的现象 化合物结构及溶剂改变等，使吸收峰向短波长方向移动的现象
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 甲苯E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
1. 有机化合物中的电子轨道及其跃迁 s键： s、s*轨道 p键： p、p*轨道
孤对电子：n轨道
σ~σ*跃迁 > n~σ*跃迁 >
σ*
π~π*跃迁 > n~π*物
En
含p键的有机物 共轭体系
π
含非键电子的不饱和有机物 杂原子 σ
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
波长/nm 分区名称 波长/mm 分区名称
<0.005 g射线 0.8~2.5 近红外光
l=650nm =4.62×1014Hz E=3.06×10-19j=1.91eV
0.005~10 X射线 2.5~50
中红外光
10~200 真空紫外 50~1000 远红外光
200~400 近紫外光 1~300mm
微波
400~800 可见光 >300mm 无线电波
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法
二、紫外-可见吸收光谱的产生 实现能量交换
1. 电磁波与电磁波的能量 c / l E h
2. 分子的能量
量子化
E 连续能 Ev Er Ee
E
n1
V3
V2
V1
n0
JJ12
第一节 基本原理
l、I0
l、I T I / I0 透光率
A lg T 吸光度
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 甲苯E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
1. 有机化合物中的电子轨道及其跃迁 s键： s、s*轨道 p键： p、p*轨道
孤对电子：n轨道
σ~σ*跃迁 > n~σ*跃迁 >
σ*
π~π*跃迁 > n~π*物
En
含p键的有机物 共轭体系
π
含非键电子的不饱和有机物 杂原子 σ
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
波长/nm 分区名称 波长/mm 分区名称
<0.005 g射线 0.8~2.5 近红外光
l=650nm =4.62×1014Hz E=3.06×10-19j=1.91eV
0.005~10 X射线 2.5~50
中红外光
10~200 真空紫外 50~1000 远红外光
200~400 近紫外光 1~300mm
微波
400~800 可见光 >300mm 无线电波
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法
二、紫外-可见吸收光谱的产生 实现能量交换
1. 电磁波与电磁波的能量 c / l E h
2. 分子的能量
量子化
E 连续能 Ev Er Ee
E
n1
V3
V2
V1
n0
JJ12
第一节 基本原理
l、I0
l、I T I / I0 透光率
A lg T 吸光度
紫外-可见分光光度法 (2)全
第二章 紫外-可见分光光度法 (Ultraviolet and Visible Spectrophotometry, UV-Vis)
2.1 紫外-可见吸收光谱 2.2 紫外-可见光度计仪器组成 2.3 吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律(新增) 2.4 分析条件选择(新增) 2.5 UV-Vis分光光度法的应用
的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变
化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和 可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。
四、检测器：硒光电池、PMT、PDA
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯， max=217nm 2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含 水 化 合 物 有 两 种 可 能 的 结 构 ： CH3CHO-H2O 及 CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长或能量的外来辐射， 这是UV-Vis定性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。
2.1 紫外-可见吸收光谱 2.2 紫外-可见光度计仪器组成 2.3 吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律(新增) 2.4 分析条件选择(新增) 2.5 UV-Vis分光光度法的应用
的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变
化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和 可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。
四、检测器：硒光电池、PMT、PDA
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯， max=217nm 2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含 水 化 合 物 有 两 种 可 能 的 结 构 ： CH3CHO-H2O 及 CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长或能量的外来辐射， 这是UV-Vis定性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。
紫外可见分光光度法在食品检测中的应用
定，A-c曲线应为经过原点旳直线，但实际
工作中直线经常发生弯曲，这称为朗伯-比
尔定律旳偏离。
原因：
吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质
不均匀引起；吸光物质不稳定引起。
摩尔吸收系数ε：
1mol/L浓度旳溶液，液层厚度为1cm时旳吸
收度。
强吸收：ε＞104；
中档强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104；
度。（吸收池厚度为10.0mm)。
c.
4、紫外-可见分光光度计旳构成、类型和使用
（1）构成：光源、单色器、吸收池、检测器、
信号处理器、显示屏
可见光源：碘钨灯、钨灯：320-2500nm
紫外光源：氢灯、氘灯、汞灯：150-400nm
玻璃吸收池：仅用于可见光区
石英池：可用于紫外光区和可见光区
选择原则：
能完全溶解样品；
在所用旳波长范围内有很好旳透光性；
纯度为“光谱纯”或经检验其空白符合要求。
处理措施：
蒸馏水煮沸清除气泡；
乙醇清除醛类、苯等杂质；
环己烷、正己烷清除苯；
氯仿预防光和空气破坏；
乙醚清除过氧化物；
烃类吸附除杂
（3）参比溶液旳选择
1）. 溶剂参比：试样构成简朴、共存组份少（基体
注意事项：
粗酶液制备时根据目旳酶旳性质选择缓冲液、温度、
时间等条件；
酶和底物旳反应条件也要恰当；
一般以检测产物变化量居多。
二、紫外-可见分光光度法
在食品检测中旳应用
（一）、食品酶分析
1、-半乳糖苷酶（乳糖酶）
以ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为
底物测定-半乳糖苷酶活力。
工作中直线经常发生弯曲，这称为朗伯-比
尔定律旳偏离。
原因：
吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质
不均匀引起；吸光物质不稳定引起。
摩尔吸收系数ε：
1mol/L浓度旳溶液，液层厚度为1cm时旳吸
收度。
强吸收：ε＞104；
中档强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104；
度。（吸收池厚度为10.0mm)。
c.
4、紫外-可见分光光度计旳构成、类型和使用
（1）构成：光源、单色器、吸收池、检测器、
信号处理器、显示屏
可见光源：碘钨灯、钨灯：320-2500nm
紫外光源：氢灯、氘灯、汞灯：150-400nm
玻璃吸收池：仅用于可见光区
石英池：可用于紫外光区和可见光区
选择原则：
能完全溶解样品；
在所用旳波长范围内有很好旳透光性；
纯度为“光谱纯”或经检验其空白符合要求。
处理措施：
蒸馏水煮沸清除气泡；
乙醇清除醛类、苯等杂质；
环己烷、正己烷清除苯；
氯仿预防光和空气破坏；
乙醚清除过氧化物；
烃类吸附除杂
（3）参比溶液旳选择
1）. 溶剂参比：试样构成简朴、共存组份少（基体
注意事项：
粗酶液制备时根据目旳酶旳性质选择缓冲液、温度、
时间等条件；
酶和底物旳反应条件也要恰当；
一般以检测产物变化量居多。
二、紫外-可见分光光度法
在食品检测中旳应用
（一）、食品酶分析
1、-半乳糖苷酶（乳糖酶）
以ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为
底物测定-半乳糖苷酶活力。
仪器分析2(紫外可见光分光光度)
白光除了可由所有波长的可见光复 合得到外，还可由适当的两种颜色的 光按一定比例复合得到。能复合成白 光的两种颜色的光叫互补色光。
/nm 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
改变溶剂的极性，会引起吸收带形状
的变化。改变溶剂的极性，还会使吸收带
的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂
对一种丙酮紫外吸收光谱的影响。
正己烷 CHCl3 CH3OH H2O
* 230
238
237 243
n * 329
315
309 305
由于溶剂对电子光谱图影响很大， 因此，在吸收光谱图上或数据表中必 须注明所用的溶剂。与已知化合物紫 外光谱作对照时也应注明所用的溶剂 是否相同。在进行紫外光谱法分析时， 必须正确选择溶剂。
电子的跃迁吸收光的波长主要在
真空紫外到可见光区，对应形成的光 谱，称为电子光谱或紫外-可见吸收光 谱。
三．有机化合物的紫外—可见吸收 光谱
（一）、跃迁类型 主要有σ→σ*、n→σ*、n→π* 、 π→π*
n
E*
* n*
* n *
a.σ→σ* 跃迁主要发生在真空紫外区。 b. π→π* 跃迁吸收的波长较长，孤立
ε（480nm）=A/ cb
= -lg0.398/0.150×10-3 ×2.00 =1.33 ×103 ( L ·mol-1 ·cm-1)
由ε=aM , 得: a= ε/M
= ε /251=5.30(L ·g-1 ·cm-1)
三．实际溶液对吸收定律的偏离及原因： （一）偏离：被测物质浓度与吸光
比色分析和紫外可见分光光度法
1、紫外可见分光光度法 （1）紫外分光光度法：利用物质分子对紫外光的 选择性吸收，用紫外分光光度计测定物质对紫外光的 吸收程度来进行定型、定量分析的方法。 波长范围：200～400nm。 （2）可见分光光度法：利用物质分子对可见光的 选择性吸收特性，用可见分光光度计测量有色溶液对 可见光的吸收程度以确定组分含量的方法，则称为可 见分光光度法。 波长范围：400～800nm。 紫外分光光度法和可见分光光度的区别在于测定 波长范围不同，通常合称为紫外、可见分光光度法。
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
紫外可见分光光度法UltravioletVisible
A1 = 1bc1 A2 = 2bc2 A = 1bc1+ 2bc2
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：
A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：
A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
第二章 紫外-可见分光光度法
入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
仪器分析-紫外可见光光谱分析
1,3,5-己三烯
正己烷
258
n=4
1,3,5,7-辛四烯
环己烷
304
不共轭双键不发生红移。
C=O双键同C=C双键的共轭作用使n→*和→*跃迁的吸收峰都发生红移。
3）溶剂效应
01
02
03
04
05
极性溶剂使π-π*跃迁发生红移。
pH值
Note: 测UV-Vis应注明溶剂
pH增大，苯酚π-π*吸收带发生红移。
1
2
特点：灵敏度高，实际工作中常用。
1
常将M与某L（显色剂）生成具有电荷迁移的配合物，然后进行含量测定。
2
－* 跃迁 配体具有双键的金属络合物
3
2.3光的吸收定律
郎伯-比尔（Lambert-Beer ）定律 入射光强度 吸光强度 反光强度 透光强度 ＋ IS 散射光强度 均匀溶液，散射光小，可忽略
由于n—π共轭参与，使分子整体共轭效应增强。
取代基 苯环或烯烃（吸电子基）上的H被各种取代基取代，多发生红移。 空间异构
蓝移（紫移）：使化合物的吸收波长向短波方向移动效应。 影响蓝移因素： 1）溶剂效应 极性溶剂使n-π*跃迁发生蓝移 2）pH值 pH值减小，苯胺的π-π*吸收带蓝移n—π共轭参与少，使分子整体π共轭效应减少。
分子转动－转动能级(rotation)
分子整体能级 E=Ee+Ev+Er
01
03
02
04
05
分子从基态能级跃迁到激发态能级
当有一频率v , 如果辐射能量hv恰好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：
激发态
基态
ΔE电=1-20eV ΔE振=0.05-1eV ΔE转 在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外—可见区。
正己烷
258
n=4
1,3,5,7-辛四烯
环己烷
304
不共轭双键不发生红移。
C=O双键同C=C双键的共轭作用使n→*和→*跃迁的吸收峰都发生红移。
3）溶剂效应
01
02
03
04
05
极性溶剂使π-π*跃迁发生红移。
pH值
Note: 测UV-Vis应注明溶剂
pH增大，苯酚π-π*吸收带发生红移。
1
2
特点：灵敏度高，实际工作中常用。
1
常将M与某L（显色剂）生成具有电荷迁移的配合物，然后进行含量测定。
2
－* 跃迁 配体具有双键的金属络合物
3
2.3光的吸收定律
郎伯-比尔（Lambert-Beer ）定律 入射光强度 吸光强度 反光强度 透光强度 ＋ IS 散射光强度 均匀溶液，散射光小，可忽略
由于n—π共轭参与，使分子整体共轭效应增强。
取代基 苯环或烯烃（吸电子基）上的H被各种取代基取代，多发生红移。 空间异构
蓝移（紫移）：使化合物的吸收波长向短波方向移动效应。 影响蓝移因素： 1）溶剂效应 极性溶剂使n-π*跃迁发生蓝移 2）pH值 pH值减小，苯胺的π-π*吸收带蓝移n—π共轭参与少，使分子整体π共轭效应减少。
分子转动－转动能级(rotation)
分子整体能级 E=Ee+Ev+Er
01
03
02
04
05
分子从基态能级跃迁到激发态能级
当有一频率v , 如果辐射能量hv恰好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：
激发态
基态
ΔE电=1-20eV ΔE振=0.05-1eV ΔE转 在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外—可见区。
第二章 紫外-可见分光光度法
分子吸收电磁辐射而发生电子能级间的跃 迁和振动能级间的跃迁时，总伴有转动能 级间的跃迁。由于转动能级间隔太小，一 般光谱仪的分辨能力不足以把这些谱线分 开，诸谱线便连成一片，表现为带状。所 以，分子吸收光谱时一种带状光谱。
Instrumental Analysis
16
Huaihua University Chemistry and chemical egineering Department
在分子中，除了原子的核能En，质心在空 间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原子 之间的相对振动能Ev以及分子转动能Er等。 分子的总能量可写为： E=En + Ee+ Ev+ Er+ Et 由于En在一般化学实验条件下不发生变化， 分子的平动能Et又比较小，因此当分子能 级发生跃迁时，能量的改变为： DE=DEe + DEr +DEv
紫外-可见分光光度法优点： 较高的灵敏度； 较好的准确度； 选择性好； 操作简便、快速； 仪器设备简单、价格低廉。
Instrumental Analysis
3
Huaihua University Chemistry and chemical egineering Department
10-2 nm 10 nm
1.远紫外（真空紫外）吸收带
烷烃化合物的吸收带，如C-C、C-H基团中，为s→s*跃迁，λmax < 170nm，范围在10-
200nm。
2.末端吸收带
饱和卤代烃、胺或杂原子的单键化合物的吸收带，为n→s*跃迁，其范围从远紫外区末端
到近紫外区，在200nm附近。
3.R带
共轭分子的含杂原子基团的吸收带，如C=O，N=O，NO2，N=N等。为n→p*跃迁，弱吸 收带， emax<100 ，随溶剂极性增加，R带会发生蓝移，附近如有强吸收带，R带有时会红 移。
紫外可见分光光度法
机理：在这一吸收过程中，实际上是发生 了一种电子从体系旳一部分（称为：电子予 以体）转移到体系旳另一部分（称为：电子 接受体）旳过程，因而这么取得旳吸收光谱 称为电荷转移吸收光谱。
类型：
i) 配位体金属旳电荷转移
例：[Fe(SCN)6]3-呈深红色，在490 nm 附近有强吸收，这就是因为该络合物吸收 了某波长旳光，使一种电子从SCN-旳某一 轨道跃迁到Fe3+旳某一轨道上。
2.3 分光光度法旳对比度 1. 对比度旳概念
在光度法中，对比度是指显色剂与金属 离子所形成络合物（MeR）旳最大吸收峰波 长(MeRmax)与显色剂本身(HnR)最大吸收峰波 长(HnRmax)之间旳差值。
对比度以来表达： =MeRmax- HnRmax
一般以为： 40 nm时，显色反应对比度较小；
第二章 紫外-可见分光光度法 (Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)
又称: 紫外-可见分子吸收光谱法 （Ultraviolet-Visible Molecular Absorption
Spectrometry）
2.1 紫外－可见分光光度法发展简史 1729年，Bouguer首先发觉溶液对光旳
ii) 金属配位体旳电荷转移 产生这种电荷转移旳必要条件是：
金属离子轻易被氧化（处于低氧化态）； 而配位体轻易被还原，配位体具有空旳反 键轨道，可接受从金属离子转移出来旳电 子。
iii)分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混
合，就能够得到漂亮旳醌氢醌暗绿色结晶， 它旳吸收峰在可见光区。
❖ 概念：配位体场吸收谱带指旳是过渡金属 水合离子或过渡金属离子与显色剂（一般是 有机化合物）所形成旳络合物在外来辐射作 用下，因为吸收了合适波长旳可见光（有时 是紫外光），从而取得旳相应吸收光谱。
第二章 紫外-可见分光光度法-2
（3）温度的影响 在分光光度法测定中，通常都选用室温 显色反应。当温度对显色反应速度可能有较 大的影响时，需要考虑温度的影响。 合适的温度可用单因素实验来确定。
（4）显色时间 这里包括两种时间：一种是由于显色反 应速度不同，达到反应完全所需的时间；另 一种是有色化合物维持稳定的时间。 这两种时间均可用单因素实验来考察。
c. 快速扫描分光光度计陆续问世 利用光分析可以跟踪化学反应历程，一 般分光光度计只适于历程为20~30 min以上的 反应，要研究速度较快的反应，就需要设计 出快速扫描分光光度计，如：多道分光光度 计（采用：多道光子检测器，整个光谱扫描 时间不到1 s）。
4. 仪器的最新进展 (1) 仪器的自动化程度大大提高；
精确求取摩尔吸收系数的方法是：在 不同带通宽度时测定表观摩尔吸收系数， 绘制表观摩尔吸收系数对带通宽度的曲线 关系图，将曲线外推到带通宽度为零处， 这时相应的摩尔吸收系构造、类型及 发展趋势 1. 构造 通常由以下5个部分组成— （1） 一个或多个辐射源； （2）波长选择器； （3）试样容器 (吸收池) ； （4）辐射换能器； （5）信号处理器和读出装置。
对吸收池的要求：主要是能透过所研究的 光谱区辐射线。
吸收池的两个光学面必须平整光洁，使用 时不能用手触摸。
按材料可分为：玻璃吸收池和石英吸收池 两种。
吸收池有多种尺寸和不同结构，吸收池 的光径可在0.1 cm~10 cm之间变化，其中以 1 cm光径吸收池最为常用，根据使用要求 选用。 在用于高浓度或低浓度测定时，可相 应地采用光径较小或较大的吸收池。
(3) 蓝移 由于取代基或溶剂极性的影响，使吸收 谱带的最大吸收波长向短波方向移动的现象 称为短移、紫移或蓝移。
《现代食品检测技术》 习题及参考答案
（1）
中的 C-C 伸缩振动
（2）
中的 C-C 伸缩振动
（3）
（4）
（5）
（6）
（7）
（8）
7．答案：(2)、(4)、(7)为红外活性，其余为非红外活性。 8．CO 的红外吸收光谱在 2170cm-1 处有一振动吸收峰。试求 CO 键的力常数。
γ= 1 K 8．答案：根据 2πc µ
则 K = (2πcγ ) 2 µ
11．答案：
。
12．用分光光度法测定甲基红指示剂的酸式离解常数，同浓度的指示剂，在不同 pH 值下用 1cm 吸收池得如下数据。试用计算法及作图法求甲基红的解离常数(在测定波长下，仅酸式 指示剂有吸收)。
缓冲溶液 pH 2.30 3.00 4.00 4.40 5.00 5.70 6.30 7.00 8.00 A531nm 1.38 1.36 1.27 1.15 0.766 0.279 0.081 0.017 0.002
9．指出下列各种振动形式中，哪些是红外活性振动，哪些是非红外活性振动。
分子结构
振动形式
（1） CH3－CH3 （2） CH3—CCl3 （3） SO2
γ（C－C） γ（C－C） γs,γas
（4） H2C CH2
(a) υ (CH)
H
C
H
H
C H
H
C (b) υ (CH) H
H C
H
+
H
C
(c) W(CH) + H
µ=
m1m2
=
12 ×16
其中 (m1 + m2 ) × L (12 + 16) × 0.02 × 1023 =1.14×10－23g=1.14×10－26Kg
紫外可见分光光度法
波长和颜色的关系
λ（nm） 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
二、物质对光的选择性吸收
1、物质对光的吸收的本质
定性分析： 1、与标准品或标准图谱对比，鉴定未知物； 2、鉴别异构体 如：顺反异构、互变异构（如酮-烯醇式） 3、纯度检查
定量分析： 1、单一组分测定 2、多组分同时测定
第二节 紫外可见分光光度计
一、紫外可见分光光度计的构造
光源
单色器 吸收池
检测 系统
信号显 示系统
（一）光源
1、作用：提供符合要求的入射光。
3、分类： （1）可见光光源：
①钨丝灯：是最常见的可见光光源，它可发射波长 为325-2500nm范围的连续光谱，其中最适宜的使 用范围是320-1000nm，除用作可见光源外，还可 用作近红外光源。
②卤钨灯
在钨丝中加入适量的卤化物或卤素，灯泡用石 英制成，具有较长的寿命和高的发光效率。
（2） 紫外光光源： 多为气体放电光源，其中应用最多的是氢灯和
➢ 以光的衍射现象和干涉现象为基础（平面反射光栅和平面 凹面光栅）Βιβλιοθήκη （三）吸收池（又称比色皿）
1、作用：盛装被测溶液和参比溶液。 2、分类： （1）玻璃比色皿：适用于可见光区。（能否用于紫 外光区？） （2）石英比色皿：适用于紫外及可见光区。
3、主要规格： 0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等。
紫外可见分光光度计基本组成
钨灯卤素 灯或氘灯
棱镜或光 栅，玻璃 或石英
紫外可见分光光度法(食品仪器分析课件)
二者关系为： A = lg(1/T) = -lgT
二、朗伯-比尔定律
当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液 时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成 正比，即
A= κbc 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长
及温度等因素有关。K可用a（吸光系数）或ε（摩尔 吸光系数）表示。 c为吸光物质浓度，b为透光液层
厚度。 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。
朗伯和比尔分别研究了吸光度与液层厚度和吸光
度与浓度之间的定量关系，合称朗伯-比尔定律，其
数学表达式为：
吸光质点浓度
A=lg(I0/It)=κbc
吸光度
吸收层厚度(cm)
物理意义: 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光 介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的 乘积成正比——分光光度法定量分析的理论基础
分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，而复合 光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。
在实际工作中，为了避免非单色光带来的影响，一般 选用峰值波长进行测定。
选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。
三、溶液本身发生化学变化
❖ 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化 学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。
h
（片）
红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm
五、指示器（数据处理） 低档仪器：刻度显示
中高档仪器：数字显示，自动扫描记录
紫外-可见分光光度法定量分析
一、单组分的定量分析 1、吸光系数法（绝对法）
2、标准对照法（直接比较法） As=kbCs Ax=kbCs
Cs=AsCx/Ax
❖ 当溶液浓度c >10-2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等 相互作用，直接影响了对光的吸收。
第二章_紫外-可见分光光度法(2)教材
5.光导纤维探头式分光光度计
镀铝反射镜
§4. 分析条件的选择
一、仪器测量条件的选择
1. 的选择
A
选择原则：最大吸收原则
A
A'
A' A
max
选max
2.狭缝的选择
狭缝↑→光单色性↓→灵敏度↓
原则：以减小狭缝宽度时，试样的吸光度不再增加为准
狭缝宽度 1 半峰宽 10
A：0.15~1.00 T: 10%~70%
调节l
改变c
二、反应条件的选择
〈一〉显色反应
1.定义
使待测物ε增大的反应（包括络合反应和氧化还原反应等等）
M + nR
MRn
显色剂
P34 （表3.3）
2.对显色反应的要求
（1）生成物的要大 （2）R的选择性要好 （3）生成物组成恒定 （4）生成物稳定性好 （5）显色条件易于控制
k
2
(
A
A 2
A
B 2
)
k
1
(
A
A 1
A
B 1
)
由于
k
2
A
B 2
k
1A
B 1
A
k
2
A
A 2
k
1
A
A 1
k 2A2lCA
k1A1lCA
(k
2
A 2
k
1
A 1
)lCA
<四>示差分光光度法
示差分光光度法
高吸光度示差法 低吸光度示差法 （高含量组分） （低含量组分）
第二章-紫外-可见分光光度法-答案
第二章 紫外－可见分光光度法一、选择题1 物质的紫外 – 可见吸收光谱的产生是由于 ( B )A. 原子核内层电子的跃迁B. 原子核外层电子的跃迁C. 分子的振动D. 分子的转动2 紫外–可见吸收光谱主要决定于 ( C )A. 原子核外层电子能级间的跃迁B. 分子的振动、转动能级的跃迁C. 分子的电子结构D. 原子的电子结构3 分子运动包括有电子相对原子核的运动（E 电子）、核间相对位移的振动（E 振动）和转动（E 转动）这三种运动的能量大小顺序为 （ A ）A. E 电子>E 振动>E 转动B. E 电子>E 转动>E 振动C. E 转动>E 电子>E 振动D. E 振动>E 转动>E 电子4 符合朗伯-比尔定律的一有色溶液，当有色物质的浓度增加时，最大吸收波长和吸光度分别是 ( C )A. 增加、不变B. 减少、不变C. 不变、增加D. 不变、减少5 吸光度与透射比的关系是 ( B ) A. T A 1=B. TA 1lg = C. A = lg T D. A T 1lg = 6 一有色溶液符合比尔定律，当浓度为c 时，透射比为T 0，若浓度增大一倍时，透光率的对数为 ( D )A. 2T OB. 021TC. 0lg 21T D. 2lg T 07 相同质量的Fe 3+和Cd 2+ 各用一种显色剂在相同体积溶液中显色，用分光光度法测定，前者用2cm 比色皿，后者用1cm 比色皿，测得的吸光度值相同，则两者配合物的摩尔吸光系数为 ( C )已知：A r(Fe) = 55.85，A r(Cd) =112.4A. Cd Fe 2εε≈B. e d F C 2εε≈C. e d F C 4εε≈D. Cd Fe 4εε≈8 用实验方法测定某金属配合物的摩尔吸收系数ε，测定值的大小决定于 ( C )A. 入射光强度B. 比色皿厚度C. 配合物的稳定性D. 配合物的浓度9 以下说法正确的是 ( A )A. 吸光度A 随浓度增大而增大B. 摩尔吸光系数ε随浓度增大而增大C. 透光率T 随浓度增大而增大D. 透光率T 随比色皿加厚而增大10 下列表述中的错误是 ( A )A. 比色法又称分光光度法B. 透射光与吸收光互为补色光，黄色和蓝色互为补色光C. 公式bc II A ε==0lg 中，ε称为摩尔吸光系数，其数值愈大，反应愈灵敏 D. 吸收峰随浓度增加而增大，但最大吸收波长不变11 吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是 ( C )A. 0.1～0.5B. 0.1～1.2C. 0.2～0.8D. 0.2～1.512 若显色剂无色，而被测溶液中存在其它有色离子干扰，在分光光度法分析中，应采用的参比溶液是 ( D )A. 蒸馏水B. 显色剂C. 试剂空白溶液D. 不加显色剂的被测溶液13 采用差示吸光光度法测定高含量组分时，选用的参比溶液的浓度c s 与待测溶液浓度c x 的关系是 ( D )A. c s =0B. c s = c xC. c s > c xD. c s 稍低于c x14 桑德尔灵敏度S 与摩尔吸光系数ε的关系是 ( A ) A. εMS = B. 610⨯=εM S C. ε610⨯=M S D. M S ε= 15下列因素对朗伯-比尔定律不产生偏差的是 ( A )A. 改变吸收光程长度B. 溶质的离解作用C. 溶液的折射指数增加D. 杂散光进入检测器二、填空题1吸光光度法进行定量分析的依据是__朗伯-比耳定律，用公式表示为___A= εbc，式中各项符号各表示：A为吸光度，b为吸收介质厚度，ε为摩尔吸光系数，c 为吸光物质的浓度。
第二章 紫外-可见分光光度法
1、光源
作用：供给符合要求的入射光。 （1）可见光光源 常见的可见光光源有：钨丝灯和卤钨灯。 （2）紫外光光源 常见的紫外光光源有：氢灯和氘灯。 •另外，为了使光源发出的光在测量时稳定，光 源的供电一般都要用稳压电源，即加有一个稳 压器。
2、单色器
作用：把光源发出的连续光谱分解成单色光，并 能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光， 它是分光光度计的心脏部分。 组成：单色器一般由狭缝、色散元件（棱镜和光 栅）、透镜系统组成。 （1）棱镜单色器 •玻璃棱镜：可吸收紫外光，只能用于可见光区域。 •石英棱镜：用于紫外、可见和近红外三个光区域。 （2）光栅单色器 •可用于紫外、可见及红外光区域，目前生产的紫外可见分光光度计大多采用光栅作为色散元件。
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
四、分光光度计的维护 1、仪器对工作环境的要求
•稳固、温度15～28℃、干燥、无腐蚀性气体、 光线不宜过强
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
2、紫外-可见分光光度计——双光束
•/vlabcq/flash/分光光度计/分光光度 计.html
二、紫外-可见分光光度计的类型及特点 1、按使用的波长范围分
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
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氘灯
钨灯 卤钨灯
185~400
320~2500 250~2000
紫外
可见，近红外 紫外，可见，近红外
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅
样品池（吸收池、比色皿）
厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
（二）偏离Lambert-Beer定律的原因
5. 浓度的限制
朗伯-比尔定律假定物质分子之间不发生相互作 用，因此只有稀溶液时才基本符合。 浓度较高时，物质分子间会互相影响对方的电 荷分布，吸光性能发生改变，必然导致偏离。朗 伯-比尔定律
三 吸光系数
吸光系数K物理意义：液层厚度为1cm的 单位浓度溶液的吸光度，它表示物质对特定 波长光的吸收能力。一个物质在一定条件下 的吸光系数为定值。通常有两种表示方法：
的有色化合物进行测定，选择具有最大ε值的波
长作入射光。
（2） 百分吸光系数
一定波长下，吸光物质的溶液浓度为 1g/100ml(1%)，液层厚度为1cm时， 溶液的吸光度。设吸光物质的摩尔质量为 M g/mol ，则：
1mol/L＝M g/1000ml＝M/10· 1g/100ml
∴
ε＝
×
例：将 1.00mg 维生素 B12（摩尔质量 为 1355）溶于 25.00ml 蒸馏水中，用 1.0cm 比色杯，在 361nm 波长下，测 得吸光度为 0.400，计算百分吸光系数。
三 吸光系数
例：用氯霉素（分子量为323.15）纯品配制 100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池， 在波长为278nm处测得其透射率为24.3%，试计 算氯霉素278nm波长处的摩尔吸光系数和百分吸 光系数。
解：已知： M=323.15g/mol c=2.00×10-3% T=24.3%
物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光 2、复合光：不同波长组成的光 3、互补色光：若两种光按适当的强度比 例混合而成白光，则这两种光称为互 补色光
引言：什么是紫外-可见分光光度法？
是根据溶液中物质分子或离子对波长为 200-760nm这一范围的电磁波（紫外和可见 光谱）的吸收特特点建立起来的一种定性、 定量和结构分析方法。
当一束单色光通过均匀的溶液时，光 的一部分被吸收，一部分透过溶液，还有 一部分被器皿表面反射。设入射光强度为 I0,吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则：
I0 I a It
1. 透光率
透射光(It)占入射光（I0） 的比例的大小称为透光 率，用T表示：
It T I0
透光率越大，溶液对光的吸收越少； 反之，透光率越小，溶液对光的吸收 越多。
吸光度A
表示物质对光的吸收程度。 吸光度A公式：
I0 A lg T lg It
透光率的负对数称为吸光度，用A表示。 A越大，表示物质的吸光能力越强。
二、朗伯--比尔定律 分光光度法定量的依据
（一） 光的吸收定律 当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射 的含有吸光物质的溶液时，在入射光的波长、 强度以及溶液的温度等因素保持不变的情况下， 该溶液的吸光度A与溶液的浓度C及溶液的厚度 b的乘积成正比关系，称为朗伯-比尔定律：
1、显色反应及其条件
可见光区的吸光光度法只能用于测定有色 溶液。
对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须将 被测组分转变成有色化合物(显色反应)。 能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为 显色剂。
显色剂必须满足下述条件：
（1）灵敏度要高：要求选择的显色剂能与待测组分生 成摩尔吸收系数较大的有色化合物。 （2）选择性要好。 （3）有色化合物稳定性好 。 （4）反应定量完成，否则再现性就较差。 （5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足 够大，一般要求相差 60 nm 以上。
第二节 紫外-可见分光光度计
吸光度与被测物质浓度的关系符合朗伯-比 尔定律，那么如何测量吸光物质的吸光度？应 该使用紫外-可见分光光度计来进行测量，其基 本结构有五部分组成：
分别为： 光源 单色器 吸收池 接受器 显示系统
光源
单色器
比色皿
检测器
显示系统
光源 ：提供入射光
常用光源
光源 氢灯 波长范围(nm) 185~375 适用于 紫外
结果显示记录系统
检流计、微安表，电位计、数字电压表、记录仪、
示波器及计算机等进行仪器自动控制和结果处理。
第三节 分析条件的选择
1、显色反应及其条件
2、测定波长的选择 3、吸光度范围的选择 4、参比溶液的选择
微量Fe3+、Cu2+的溶液，如何用可见分 光光度法进行测量？通过显色反应，使无色 或浅色的溶液转化成有色的溶液，借此进行 测量。
那么光的本质是什么？ 光具有波动性，用波长(λ)和频率(ν)表 示；光具有粒子性，用能量(E)表示不同波长 的光具有不同的能量。
既然太阳光可以色散成各种波长的有色光， 但为什么平时我们却看不到有色光？
把适当颜色的两种光按一定强度比例混合能 成为白光，这两种颜色的光称为互补光。太阳 光中各种色光两两互为互补，成为白光，所以 我们看到的太阳光是无色的。
互补色光示意图
为什么我们看到的物质具有不同的颜色？ 这是因为物质选择性吸收了某种颜色的光， 而呈显出被吸收光的互补光的颜色。
如: CuSO4溶液选择性地吸收白光中间的黄色 光，故CuSO4溶液呈蓝色。 [Fe(SCN)6]3-呈血红色，说明其溶液选择 性地吸收白光中的青色光。 如果溶液不吸收白色光，则溶液表现为 无色透明；如溶液对所有颜色的光全部吸收， 则溶液呈黑色。
（二）偏离Lambert-Beer定律的原因
4. 溶液本身发生化学变化的影响
溶液中待测组分发生了解离、缔合等作用， 造成物质光化学性质改变，偏离了偏离朗伯-比 尔定律。例如，铬酸盐在溶液中有如下平衡： 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42橙色 黄色 lnm=350nm lnm=375nm Cr2O72-呈橙色，而 CrO42- 呈黄色，二者对 不同波长 的光线的吸收性能完全不同。
四 吸收光谱
由高锰酸钾溶液吸收光谱曲线，我们可得到如 下信息： ⑴ 高锰酸钾溶液对不同波长的光的吸收程 度是不同的，对波长为525nm的绿色光吸收最多， 在吸收曲线上有一高峰（称为吸收峰），而对红色 光和紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此 KMnO4溶液呈紫红色。光吸收程度最大处的波长称 为最大吸收波长（常以λ max表示）。在进行光度 测定时，通常都是选取在λ max的波长处来测量， 因为这时可得到最大的测得灵敏度。
“十一五”国家规划教 材
第二章
紫外-可见分光光度法
学习目标
1. 掌握紫外-可见可见分光光度法的原理；
2. 熟悉紫外-可见可见分光光度计的结构及各部 分作用，了解不同类型分光光度计的结构； 3. 了解紫外-可见分光光度法实验条件的选择； 4. 掌握紫外-可见分光光度计的定性定量方法。
补充内容 --- 光的性质
主要内容
§2.1 §2.2 §2.3 §2.1 基本原理 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 紫外-可见分光光度法的应用
§4.1 基本原理
透光率和吸光度 光的吸收定律 偏离朗伯-比尔定律 的因素
基 本 原 理
Lambert-Beer定律 吸光系数
摩尔吸光系数
百分吸光系数
吸收光谱
一、透光率和吸光度
⑵ 不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相
似，最大吸收波长也一样，不过峰高不相同。不同物质 的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此， 可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。 ⑶ 不同浓度的同一种物质的溶液，若在相同的波长 处测量，其所测得的吸光度随浓度的增加而增大，吸收 峰也随之增高。这便是物质定量分析的理论依据。
M + R
lmax 溶剂 光 学 透 明
吸收 吸收 吸收 吸收
= M-R lmax 参比液组成
溶剂 不加显色剂的试液 显色剂+溶剂
显色剂
无吸收 无吸收 吸收 吸收
吸光物质
显色剂 + 试液 + 待测组分的 掩蔽剂
第四节 紫外-可见分光吸收光谱法的应用
1. 定量分析
定量依据：朗伯-比耳定律， 吸光度 A= b c 灵敏度高： max在104～105 之间 吸光度在0.2-0.8之间，误差较小，测定较准确。
摩尔吸光系数 吸光系数
百分吸光系数
K值的大小取决于吸光物质的性质、入射 光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓 度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液
溶液的浓度以物质的量浓度（mol· L-1）表示，液层
厚度以厘米（cm）表示时，相应的比例常数K称为摩尔 吸光系数。以ε表示，其单位为L· mol-1· cm-1。这样，比
3、吸光度范围的选择
控制浓度
吸光度A：0.2～0.8
4. 参比液的选择
原则： 扣除比色皿、样品基体（非待测组分）和显色剂的吸收
A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池） A （参比） = A （干扰）+ A （池） 以显色反应为例进行讨论 若欲测 M-R 的吸收 试样
无吸收 基体吸收 无吸收 基体吸收
例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此 化合物用乙醇作溶剂配制成浓度为0.150mmol· L－ 1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透 光率为39.8％，求该化合物在上述条件下的摩尔 吸光系数ε解：由Lambert-Beer定律可得