微生物生化鉴定

常用生化试验

一．糖、醇发酵试验

1.糖、醇发酵试验原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气，有的仅产酸，而不产气。根据这些特点，可鉴别细菌。

培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。可根据试验的要求和细菌的特性来选择。

2.乙酰甲基甲醇试验（V-P 试验）

原理：某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的

a -萘酚为催化剂，可加速此反应，使反应颜色增加，

提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V-P 试验呈阴性。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基

3.甲基红试验（MR 试验）原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH 降至

4.5 以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在PH6.2 以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基

MUG 葡萄糖醛酸苷酶试验

原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4-甲基伞形酮-3 -D葡萄糖醛酸甘

（4-Methylumbelliferyl- 3 -D-glucuronide简称MUG ）的3葡萄糖醛酸甘键，使其水解，释

放的4-甲基伞形酮在366nm 紫外灯下产生蓝白色荧光。

培养基：MUG 培养基

4.3-半乳糖苷酶试验

原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和3-半乳糖苷酶两种不同的酶作用，

能水解邻硝酸酚-3-D 半乳糖苷（O-nitrophenyl- 3-D-galactopyranoside,ONPG ），而释放出黄色

的邻硝酸酚。发酵乳糖的细菌具有上述两种酶，可迅速分解乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌只有

3■半乳糖苷酶，而缺少半乳糖苷渗透酶或是其活性很弱，不能将乳糖很快运送到菌细胞内，

通常需要延长培养时间数天，乳糖才被分解。本实验主要鉴别肠道细菌，乳糖发酵及乳糖迟

缓发酵菌为阳性反应，非乳糖发酵酶为阴性。本试验可作为迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定方法。

5•葡萄糖氧化-发酵（0/F）试验

原理：细菌对糖的代谢分为氧化型和发酵型两种。在有氧环境下氧化完全，生成二氧化碳和

水。在无氧环境下，进行不完全的分解（发酵），生成酸类、醇类和气体。氧化型的细菌在

无氧环境中，不能分解糖。发酵型的细菌无论在有氧或是无氧的环境中均可分解糖。葡萄

糖氧化-发酵试验有助于假单胞菌、硝酸盐阴性杆菌、粪产碱杆菌的鉴别。

培养基：氧化发酵试验培养基

6•石蕊牛乳试验

原理：牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均能在其生长，但各种细菌对这些物质的分解能力不同，可观察的反应也不同，在培养基中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂，可观察到不同的反应结果。

产气荚膜梭菌对牛乳具有强烈的发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所

产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种暴风雨”样的

发酵现象称为汹涌发酵”为该菌所特有。乳链球菌可使牛乳培养基产酸、凝固，并可使石

蕊还原。

培养基：石蕊牛乳培养基

二.氨基酸和蛋白质代谢试验

1.靛基质试验

原理：某些细菌，如大肠埃希菌、变形杆菌等，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，形成靛基

质（吲哚）。靛基质无色，与试剂对二甲氨基苯甲醛作用后，形成红色化合物-玫瑰靛基质。

本试验常用于肠杆菌科种属鉴别，大肠埃希菌98%为阳性反应，肺炎克雷伯菌、沙门菌为

阴性反应。

培养基: 胰蛋白胨水培养基

2.硫化氢产生试验

原理：检查肠杆菌科娥硫化氢试验，是利用细菌对于培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸

钠的还原作用，生成硫化氢。硫化氢是无色气体，遇硫酸亚铁或枸橼酸铁铵，产生不溶性黑

色沉淀物硫化亚铁。

按此原理设计的硫化氢试验，适用于肠杆菌科细菌的鉴定。沙门菌，弗劳地枸橼酸杆菌，缓

慢爱德华菌，莱克勒菌属和变形杆菌属为阳性反应，其他细菌均为阴性反应。在沙门菌属中，亦有硫化氢阴性的菌型，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等，伤寒沙门菌中亦有部分菌株为硫化氢阴性。

培养基：二糖铁琼脂或克氏双糖铁琼脂培养基。

3•尿素酶试验

原理：某些细菌，如变形杆菌具有尿素酶，能分解培养基中的尿素而产生大量的氨，使培养

基成碱性，培养基中的酚红指示剂呈红色。

本试验常用语鉴别变形杆菌属。变形杆菌属能分解尿素呈阳性反应，其他肠道细菌的尿素酶

试验多数为阴性反应。

培养基：尿素培养基

4•明胶液化试验

原理：明胶是一种胶原蛋白，不具有一般蛋白质加热凝固的特性，其水溶液在24摄氏度以

下为凝胶状态。明胶可被细菌的胶原酶分解为氨基酸，分解后的明胶，凝固力降低，低于20摄氏度不再凝固，呈液化状态。

本试验为细菌鉴定的常规实验法。铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌，腐败假单胞菌等为阳

性反应，肠杆菌科细菌很少液化明胶。

培养基：明胶培养基。

5•氨基酸脱羧酶试验

原理：细菌分解氨基酸使其脱羧，生成胺和二氧化碳，此为脱羧反应，需要细菌所产生的脱

羧酶完成反应。各种细菌产生的脱羧酶不同，对各种氨基酸底物所产生的胺亦不相同，但均可使培养基变碱，由培养基中的指示剂显示出来。

培养基: 氨基酸脱羧酶培养基

6•精氨酸双水解酶试验

原理：细菌分解精氨酸产碱不限于精氨酸脱羧酶。精氨酸可通过精氨酸脱酰胺酶及瓜氨酸酶，

经两次水解，先生成瓜氨酸和氨，后形成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在鸟氨酸脱羧酶

的作用下生成腐胺及二氧化碳。

氨和腐氨均为碱性，由培养基中的指示剂显示出来。

培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶培养基或用Thomley精氨酸培养基，后者常用于假单胞

菌属鉴定。

7•苯丙氨酸脱氨酶试验

原理：变形杆菌属可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入三氯