发酵整理

1,1833年，法国化学家Anselme Payen (佩恩)和 Jean-Francois Persoz (帕索兹) :

用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶(diastase) 。

2,1926年，美国康乃尔大学的“独臂学者” Sumner(萨姆纳) 博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。在此后的50多年，对一系列酶的研究，都证实了酶的化学本质是蛋白质。

3，1983年，Sidney Altman(阿尔特曼)等人发现核糖核酸酶P(RNase P)的RNA组分(M1 RNA)具有加工tRNA前体的催化功能。而RNase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。

4，酶分为蛋白类酶和核酸类酶

1蛋白类酶包括 1氧化还原酶2转移酶3水解酶4裂合酶5异构酶6合成酶或连接酶

2核酸类酶包括 1分子内催化核酸类酶2分子间催化核酸类酶.

3分子内催化核酸类酶包括 1自我剪切酶2自我剪接酶

4分子间催化催化核酸类酶包括 1 RNA剪切酶2DNA剪切酶3多肽剪切酶4多糖剪切酶5多功能核酸类酶

5系统类酶的命名法采用四码编号方法，第一个号码表示该酶属于6大类酶中的某一大类，第二个号码表示属于该大类的某一亚类，第三个号码表示亚类中的小类，第四个号码表示在小类中的序号。

6分类原则 1按催化作用的类型，将蛋白类酶分为6大类2每个大类中，按照酶作用的底物，化学键或基团的不同，分为若干亚类3每一亚类中再分为若干小类4每一小类中包含若干个具体的酶。

7酶活力的测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法

8酶活力测定的基本步骤：1根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配成一定浓度的底物溶液2根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度，PH,底物浓度，激活剂浓度等反应条件。3在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混匀，适时记下反应开始的时间。4反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。

9酶活力---指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。单位有IU, U,Kat。

10酶的转换数也称为催化常数，表示酶催化中心的活性大小，指单位时间(如每秒)内每一催化中心(或活性中心)所能转化的底物分子数，或每摩尔酶活性中心单位时间转换底物的摩尔数。

11转换数的倒数称为酶的催化周期，是指酶进行一次催化所需的时间。单位为毫秒(ms)或微秒(μs),即T=1/Kcat

12固定化酶的活力测定：1振荡测定法2酶柱测定法3连续测定法

13，1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。

14，在DNA中，与酶的四种生物合成密切相关的基因有四种，调节基因，启动子，结构基因，操纵基因。调节基因可产生一种阻遏蛋白。结构基因与操纵基因，启动子一起组成操纵子。

15，分解代谢物阻遏原理与方法，物质分解代谢释放能量，一些能量存在ATP中，使AMP浓度降低，存在细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶水解成AMP,腺苷酸环化酶的活化受抑制而使cAMP的生成受阻，导致胞内cAMP的浓度降低，使cAMP-CAP的复合物的浓度随之降低，启动子的相应位点没有足够cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就没法结合到启动子的特定位点。RNA聚合酶也随之结合到相应的位点上，酶的生物合成才能进行。分解代谢阻遏作用及其阻遏解除，实质上是cAMP通过启动子对酶生物合成的调节控制。

17真核生物酶生物合成的调节

1细胞分化改变酶的生物合成2基因扩增加速酶的生物合成3增强子促进酶的生物合成4抗原诱导抗体酶的生物合成。

18抗体酶的制备方法主要有诱导法和修饰法。诱导法又分为半抗原诱导抗体酶的生成和酶蛋白诱导法19产酶细胞的选择：（1）酶的产量高（2）容易培养和管理(生长速率高、营养要求低)（3）产酶稳定性好，不易退化（4）利于分离提纯（5）安全可靠，无毒性

20 （1）不同的细胞，其生长繁殖的最适PH有所不同。

细菌、放线菌：中性或碱性，pH6.5~8.0霉菌、酵母菌：偏酸性，pH4~6植物细胞：偏酸性，pH5.2~5.8 动物细胞：偏碱性，pH7.2~7.6

（2）细胞产酶的最适PH与生长最适PH往往有所不同。

细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。

碱性蛋白酶：碱性（pH 8.5~9.0）

中性蛋白酶：中性或微酸性（pH 6.0~7.0），

酸性蛋白酶：酸性（pH 4~6）

例外：有些酶在其催化反应的最适条件下，产酶细胞的生长和代谢可能受到影响

如枯草杆菌碱性磷酸酶，其催化反应的最适pH值为9.5，而其产酶的最适pH值为7.4

（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，可改变各种酶之间的产量比例。

21调节溶解氧的方法：（1）调节通气量；（2）调节氧的分压；（3）调节气液接触时间；（4）调节气液接触面积；（5）改变培养液性质。

22细胞在一定条件下培养牛长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期4个阶段

23酶生物合成四种类型

1同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式(生长偶联型) 。

特点：(1)酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

(2)当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。

举例：例如，米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶或称为鞣酸酶

2延续合成型酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。

特点：（1）该类酶可受诱导，一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。

（2）该酶对应的mRNA是相当稳定的。

举例：黑曲霉合成聚半乳糖醛酸酶

3中期合成型是酶的生物合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止的一种合成模式。

特点：（1）酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。（2）所对应的mRNA是不稳定的。

举例：枯草杆菌合成碱性磷酸酶（受磷酸反馈抑制）

4滞后合成型滞后合成型又称非生长偶联型，是酶的生物合成在细胞生长进入平衡期以后才开始并大量积累的一种合成模式。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。

特点：（1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。

（2）该酶对应的mRNA稳定性高。

举例：黑曲霉酸性蛋白酶(羟基蛋白酶)合成

5影响酶生物合成模式的主要因素

1）mRNA的稳定性高：可在细胞停止生长后继续合成酶。

低：随着细胞停止生长而终止酶的合成

2）培养基中阻遏物的存在

不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。

受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。

24细胞生长动力学p56式子

莫诺德生长动力学模型

S为限制性基质的浓度，Um为最大比生长速率，是指限制性基质浓度过量时的比生长速率，即当S》Ks时，u=um，Ks为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。莫诺德方程与酶反应动力学的米氏方程相似，其最大比生长速率um和曼诺德常数也可以通过双倒数作图法求出。

25固定化细胞发酵产酶的特点。1产酶率提高——细胞密度增大，生化反应加速，提高产酶率2可以反复使用或连续使用较长时间——细胞不易脱落流失3稳定性好——受载体保护，细胞适应性宽，能稳定发酵4缩短发酵周期，提高设备利用率——可预培养再转入发酵5产品容易分离纯化——细胞不溶于水，发酵液中游离细胞少6适用于胞外酶等胞外产物的生产。

26固定化原生质体(immobilized protoplasts)是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。

1无细胞壁，减少扩散屏障，可以生产部分胞内酶

2原生质体是脆弱的，通过固定化提高其稳定性。

27固定化原生质体发酵产酶工艺条件控制注意点