慢病毒载体构建及包装流程

慢病毒载体构建及包装流程

（一）实验流程（1和2为并列步骤）

1.慢病毒过表达质粒载体的构建

设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。

2.慢病毒干扰质粒载体的构建

合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体

3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

(二) 实验材料

2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株

该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

载体信息

1) 慢病毒克隆载体图谱如下：

2） 包装质粒信息如下：

PMD2G 载体图谱和序列信息

PSPAX2载体图谱和序列信息：

细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

(三)流程图