慢病毒载体构建及包装流程
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
?2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、-80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
慢病毒包装操作方案
v1.0 可编辑可修改慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM InvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。
? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表 达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞 于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打 可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将 所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenPEG6000溶液50%WakoHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶III启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶HI有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA 聚合酶I遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶H依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构(stem loop)。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于RNA聚合酶I启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒包装步骤及注意事项
慢病毒包装步骤及注意事项现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。
此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。
瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。
但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。
多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。
转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。
DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug 不含内毒素的质粒进行转染。
质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。
不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。
转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。
其它方法有脂质体法和PEI法。
转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。
如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012IU/ml的慢病毒载体。
之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-800C储存。
储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。
病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107IU/ml，浓缩之后可以达到109-107IU/ml 。
含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa 试剂盒。
一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24gag。
然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
慢病毒载体包装构建过程
缓病毒载体包拆构修历程之阳早格格创做本理：缓病毒载体不妨将中源基果大概中源的shRNA灵验天调整到宿主染色体上，进而达到少期性表黑手段序列的效验.正在熏染本领圆里可灵验天熏染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、搞细胞等多种典型的细胞，进而达到良佳的的基果治疗效验.对付于一些较易转染的细胞，如本代细胞、搞细胞、没有瓦解的细胞等，使用缓病毒载体，能大大普及手段基果大概手段shRNA的转导效用，且手段基果大概手段shRNA调整到宿主细胞基果组的几率大大减少，不妨比较便当快速天真止手段基果大概手段shRNA的少暂、宁静表黑.观念：缓病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 根源的一种病毒载体，缓病毒载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息，是缓病毒载体系统的主要组成部分.携戴有中源基果的缓病毒载体正在缓病毒包拆量粒、细胞系的辅帮下，通过病毒包拆成为有熏染力的病毒颗粒，通过熏染细胞大概活体构造，真止中源基果正在细胞大概活体构造中表黑.辅帮身分：缓病毒载体辅帮身分包罗：缓病毒包拆量粒战可爆收病毒颗粒的细胞系.缓病毒载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息.缓病毒包拆量粒可提供所有的转录并包拆RNA 到沉组的假病毒载体所需要的所有辅帮蛋黑.为爆收下滴度的病毒颗粒，需要利用表黑载体战包拆量粒共时共转染细胞，正在细胞中举止病毒的包拆，包拆佳的假病毒颗粒分泌到细胞中的培植基中，离心博得上浑液后，不妨曲交用于宿主细胞的熏染，手段基果加进到宿主细胞之后，通过反转录，调整到基果组，进而下火仄的表黑效力分子.基根源基本理：缓病毒载体系统由二部分组成，即包拆身分战载体身分.包拆身分：由HIV-1基果组去除了包拆、顺转录战调整所需的顺式效用序列而构修，不妨反式提供爆收病毒颗粒所必须的蛋黑.包拆身分常常被合并构修到二个量粒上，一个量粒表黑Gag战Pol蛋黑，另一个量粒表黑Env蛋黑，其手段也是落矮回复成家死型病毒的大概.将包拆身分与载体身分的3个量粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可正在细胞上浑中支获惟有一次性熏染本领而无复造本领的、携戴手段基果的HIV-1载体颗粒.载体身分：与包拆身分互补，即含有包拆、顺转录战调整所需的HIV顺式效用序列，共时具备同源开用子统造下的多克隆位面及正在此位面拔出的手段基果.为落矮二种身分共源沉组回复成家死型病毒的大概，需尽管缩小二者的共源性，如将包拆身分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)坐时早期开用子、3′LTR换成SV40 polyA等.一、真验过程（1战2为并列步调）安排上下游特同性扩删引物，共时引进酶切位面，PCR(采与下保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA 量粒大概者文库）调与手段基果CDS区（coding sequence）连进T载体.将CDS区从T载体上切下，拆进缓病毒过表黑量粒载体.合成siRNA对付应的DNA颈环结构，退火后连进缓病毒搞扰量粒载体3. 缓病毒载体的包拆与浓缩杂化造备缓病毒脱梭量粒及其辅帮包拆本件载体量粒，三种量粒载体分别举止下杂度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 调换为真足培植基，培植24战48h后，分别支集富含缓病毒颗粒的细胞上浑液，病毒上浑液通过超离心浓缩病毒.二、真验资料2.1缓病毒载体、包拆细胞战菌株该病毒包拆系统为三量粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2.其中量粒上的ZsGreen1表黑框能表黑绿色荧光蛋黑（GFP）.载体疑息1)缓病毒克隆载体图谱如下：2）包拆量粒疑息如下：PMD2G载体图谱战序列疑息PSPAX2载体图谱战序列疑息：细胞株293T，缓病毒的包拆细胞，为揭壁依好型成上皮样细胞，死少培植基为DMEM(含10% FBS).揭壁细胞经培植死少删殖产死单层细胞. 菌株大肠杆菌菌株DH5α.用于扩删缓病毒载体战辅帮包拆载体量粒.三、过程图。
慢病毒载体构建
第一天
第二天
第三天
第四天
第五、六天
可选:等一天 测序结果
D1.引物设计（NCBI、Prime5）
• 添加酶切位点和保护碱基（推荐XbaI、NotI）
需要确定自己的目的序列是否有相同酶切位点 序列，有则不能用
D2.PCR扩增、跑胶、胶回收、连接T载、 转化
D3.挑菌、摇菌、送样检测、菌液扩增
每次两个重复，每板挑4-6个菌
24H
48H
3.慢病毒收集和浓缩并感染目的细胞
4.筛选稳定表达的细胞株
注意事项
谢谢大家
学到了就要教人，赚到了就要给人
慢病毒载体构建
演讲人：华仁武
导师：雷明刚
1.整体步骤
1.质粒构建
(1).超表达载体穿梭质粒 (2).shRNA
（1）.质粒构建步骤（以CD513B为例）
引物 设计
PCR扩增、连接T 载、转化
挑菌、摇菌、送 样检测、菌液扩 增
提质粒、双酶切、 连接cd513b、 转化
挑菌、摇菌、 PCR检测、菌液 扩增，提质粒、 双酶切验证
D4:提质粒、双酶切、连接cd513b、转化
D5、6挑菌、摇菌、PCR检测、菌液扩增， 提质粒、双酶切验证
2.病毒包装
前期准备 • A目的载体：将目的基因片段连到慢病毒载体上，酶切，连接， 转化，抽质粒，测序 • B包装质粒：三个质粒按照以下比例混合PMDLG：PMDG: PRSV (2:1:1),混成终浓度为1mg/ml（至少要达到0.75mg，传的代数 不要太多 • D 试剂：慢病毒转染试剂（我们用的是fugene6），polybrene (病毒感染用), opti
RNAi慢病毒载体构建和包装手册 version2
SHANGHAI GENECHEM CO., LTD.RNAi慢病毒载体构建实验方法Version2.0吉凯基因二零一零年五月目录第一部分RNAi慢病毒载体的制备实验流程 (3)实验材料 (4)s i R N A靶点设计 (6)双链D N A O l i g o制备 (8)克隆制备与鉴定 (9)第二部分RNAi慢病毒包装与滴度检测实验流程 (13)实验材料 (14)L e n t i v i r u s病毒包装 (18)病毒的收获及浓缩 (19)L e n t i v i r u s滴度测定 (21)参考文献 (24)第一部分RNAi慢病毒载体的制备实验流程首先合成含干扰序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR 鉴定阳性重组子后，送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆即为构建成功的目的基因RNAi 慢病毒载体(构建流程见Fig.1)。
Fig.1 RNAi 慢病毒载体构建流程图实验材料1.试剂试剂名称试剂来源Cat.No. PCR用试剂primer（R&F）上海吉凯基因技术有限公司合成Taq polymerase Takara DR010sdsDNA oligo上海吉凯基因技术有限公司合成QIAGEN Plasmid 大抽KitQIAGEN 12163BSA上海捷倍思基因技术有限公司LB or SOB or SOC ATCC 40423CaCL2上海越俊生化有限公司T4 DNA ligase NEB M0202v T4 DNA ligase buffer NEB M0203vMgSO4上海吴化化工有限公司琼脂糖赛百盛GA4-100250bp DNA ladder Marker 捷瑞DL250+,100Tpositive clone 测序美季ABI3733 Age I NEB R0552V EcoR I NEB R0101V Hpa I NEB R0105V Xho I NEB R0146V2.仪器仪器名称仪器来源Cat.No.稳压电泳仪上海西巴斯DY-A凝胶成像仪天能公司Tanon 2500细菌摇床华利达实验设备公司HI-9211K细菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司GHP9080PCR仪Applied Biosystems 2720 thermal cycler高速离心机日立公司TGL-16G-A 一次性平皿湖南长沙天地人生物科技有限公司1L烧瓶金坛市晶玻实验仪器厂1111.1115 50 ml 聚丙烯管上海吴化化工有限公司Gilson移液器吉尔森公司siRNA靶点设计针对目的基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，根据吉凯多年的设计经验和设计软件进行评估测定，选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程；除了自行设计的siRNA靶点序列之外，我们也使用一些RNA干扰实验中公认序列，比如RNAi阴性对照（Negative Control,NC）Scramble序列（TTCTCCGAACGTGTCACGT）；同时，siRNA靶点序列亦可由客户提供，我们将根据客户的不同要求将目的序列构建到相应的慢病毒载体上。
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，公司网址：有需要请联系丘先生病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C 保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
慢病毒包装实验
慢病毒包装试验慢病毒包装试验慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础进展起来的基因治疗载体。
慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。
现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 讨论以及活体动物试验中。
一、试验流程图 1、慢病毒包装试验流程图二、试验仪器与试验材料psPAX2 质粒，pMD2.G 质粒，pHBLVTM系列质粒；293T 细胞；wan全培育基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。
三、试验步骤1. 质粒扩增。
将构建好的慢病毒载体和包装质粒使用大抽试剂盒进行质粒的去内毒素抽提，浓度建议不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.71.8 间方可用于病毒包装。
推举使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。
2. 脂质体转染。
转染前一天，在10 cm皿中接种生长状态良好的293T细胞，以第二天汇合度能达到 30% ～ 50% 为宜。
24 h 后转染，转染前需要把 DMEM 和慢病毒包装专用转染试剂 LentiFitTM恢复至室温，使用前需摇匀。
每个皿的质粒成分如下：表 1、慢病毒包装转染体系用于包装的三个质粒摩尔比通常为 1:1:1，可以依据情况稍加调整。
请参考 LentiFitTM转染试剂说明书进行转染操作，转染后46 h 换新鲜培育基。
3. 病毒收集和离心。
转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液），将收集的上清用0.45 μm滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。
4. 病毒重悬和保存。
弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于80 ℃ 或液氮罐保存。
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慢病毒载体构建及包装流程
（一）实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。
将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
(二) 实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。
其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
载体信息
1) 慢病毒克隆载体图谱如下：
2） 包装质粒信息如下：
PMD2G 载体图谱和序列信息
PSPAX2载体图谱和序列信息：
细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
(三)流程图。