喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测
人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析
ＰＩ１３跹豢藏第毛…如ｗｗｗ．ｐｉｂｂ．ａｃ．ｃｎＲｅＳｅａｒＣｈＰａｐｅｒＳ研究快报人￡ＣＲＧｊ基因启动子的鉴定与初步分析木谢海龙，）”陈主初２）李金花・’（１）南华大学肿瘤研究所，衡阳４２１００ｌ：２）中南大学肿瘤研究所，长沙４１００７８）摘要却ｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏ眦ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１（Ｌｃ尺ＧＪ）是一个喉癌候选抑瘤基因，为进一步深入研究其转录调控机制，应用５’ＲＡｃＥ技术确定了该基凼的转录起始位点，然后在对人￡ｃＲＧＪ基因进行生物信息学分析的基础上，通过ＰｃＲ定向克隆和酶切业克隆策略，构建了１１种含不同长度ＬｃＲＧＪ启动子荧光素酶报告基凶重组体．启动子活性分析表明，一１６９～＋１２７区域的启动子活性最高．研究提示，ＬｃＲＧＪ基因转录所必需的基因启动子序列在一１６９～＋１２７范围内．关键词￡ｃ尺ＧＪ，喉癌，启动子，转录调控学科分类号Ｑ７４喉癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，是由遗传和环境等诸多因素相互作用所致，涉及到大量相关基因结构和表达调控的改变，尤其是瘤基因的活化和抑瘤基因的失活起到关键性作用，但喉癌发病的分子机制至今仍不清楚【Ｉ，２Ｊ．因而分离和鉴定与喉癌发病相关的基因将是阐明其癌变机制与易感性的关键，对其临床诊断和治疗也有较重要的意义．我们在２０００年采用ｍＲＮＡ差异显示和ｃＤＮＡ文库筛选技术，克隆了在喉癌组织中表达下调新基因￡ＣＲＧＪｆ（ＧｅｌｌＢａｌｌｋ登录号为Ａｆ２６８３８７）【３卅．将￡ｃＲＧＪ基因转染到喉癌细胞Ｈｅｐ．２中，发现￡Ｃ兄ＧＪ能显著抑制移植瘤的生长同．研究发现，Ｌ积ＧＪ表达水平的改变是喉癌发病的重要因素，而￡ＣＲＧＪ『转录调控的机制目前尚不清楚．因此，本研究利用５，ＲＡＣＥ确定￡衄Ｇ，转录起始位点，克隆人己ｃ尺ＧＪ『基因５７调控区并对其功能进行了初步分析．１材料与方法１．１材料ＣＯＳ７细胞株购自美国ＡＴＣＣ公司；人肝癌细胞７７２ｌ为本实验室保存；ＤＭＥＭ、胎牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；Ｔａ勋ＲａＬＡＴａｑ。
人类新干线SLC1A5基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤关系的研究
人类新干线SLC1A5基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤关系的研究高速公路上有时会出现车流密集的情况，车辆快速驶过，但也会因为拥堵而缓慢前行。
而人体细胞内的基因调控也如同车流，有时会快速进行，有时则受到外部环境的影响而缓慢进行。
近来，关于基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤的关系，引起了不少科学家们的兴趣和研究。
其中，人类新干线SLC1A5基因启动子区就是研究的热点之一。
1. 基因启动子区简介基因启动子区是基因调控中的一个重要部分，它位于基因上游区域，是基因表达的关键。
一般来说，基因表达的过程中，先由启动子区调节基因表达的开关，再由转录因子等蛋白质介导的基因核糖体的结合以及翻译而得出蛋白质。
因此，基因启动子区的调控对于基因表达和细胞功能的正常发挥起到至关重要的作用。
2. DNA甲基化过程DNA甲基化是DNA分子上甲基基团（-CH3）与胸腺嘧啶（Cytosine）的5 位碳上形成共价结合的化学修饰。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学机制，可影响基因表达以及染色体稳定性。
甲基化作为一种关键的表观修饰，因为影响基因表达而具有重要的生物学意义。
3. SLC1A5基因简介SLC1A5基因位于人类染色体19号，是一种编码为神经递质上清运体的膜蛋白。
它在胶质细胞、肺组织和胃黏膜等多个组织中表达，它的功能是调控细胞内谷氨酸水平，以满足细胞的生长和增殖需要。
4. SLC1A5基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤的关系近年来的研究表明，SLC1A5基因启动子区的DNA甲基化与恶性肿瘤的发生密切相关。
在肺癌、结肠癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中，SLC1A5基因启动子区甲基化水平显著增加。
而通过DNA甲基化抑制剂的作用，可以减少基因启动子区的甲基化水平，从而起到抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用。
此外，SLC1A5基因启动子区DNA甲基化水平的变化也与癌细胞的侵袭和转移有关，因此可以作为肿瘤早期诊断和治疗的重要指标。
5. DNA甲基化在恶性肿瘤治疗中的应用现今的治疗手段中，越来越多的专家将目光放在了DNA甲基化的治疗上。
痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌诊断的意义
痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌诊断的意义GUO Qi;HU Jiao;SONG Yongchun;ZHANG Yi;HU Mingjun【摘要】目的研究肺癌患者的肿瘤组织及痰液标本麻素受体相互作用蛋白-1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因及其甲基化,分析讨论痰液基因甲基化对于肺癌早期诊断的意义. 方法通过甲基化特异性PCR(MSP)法对于80例肺癌患者的肺癌组织、癌旁组织及痰液标本和30例健康对照者的痰液标本进行基因甲基化检测.并且分析痰液CNRIP1基因甲基化发生与患者的性别、吸烟状况、病理分型、病理分期之间的相关性. 结果肺癌组织CNRIP1基因甲基化发生率为85％,而癌旁组织其甲基化发生率为8.75％,差异具有统计学意义(P＜0.01);痰液标本中肺癌患者痰液CNRIP1基因甲基化发生率为78.75％,健康对照组痰液基因甲基化发生率仅为3.33％,差异具有统计学意义(P＜0.01).痰液CNRIP1基因甲基化状态与性别、吸烟状况、病理分期等无相关性,但是,在鳞癌患者外周血标本中,其甲基化发生率(91.1％)较其他类型肺癌患者明显增高,差异具有统计学意义(P =0.009). 结论痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌的早期诊断具有较高的敏感度和特异度,并且对于肺鳞癌的诊断具有更高的敏感度,对于肺癌的病理分型具有一定的理论指导意义.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2019(050)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】肺癌;肺鳞癌;CNRIP1甲基化;早期诊断【作者】GUO Qi;HU Jiao;SONG Yongchun;ZHANG Yi;HU Mingjun【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是目前威胁人类健康最常见的恶性肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤居于首位[1]。
喉鳞状细胞癌ESRRG基因启动子甲基化及临床意义研究
筛选喉癌相关基因LCRG1的有效沉寂序列
筛选喉癌相关基因LCRG1的有效沉寂序列段朝军;蒋铁斌;李萃;章晓鹏;李茂玉;肖志强;汤参娥;易红;陈主初【期刊名称】《中南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(33)6【摘要】目的:拟采用RNA干扰技术筛选有效的针对LCRG1基因的打靶序列.方法:首先采用PCR定点突变技术改造pSuper载体,而后利用该改造后的载体构建针对LCRG1基因的5对打靶序列的真核表达载体.将构建的重组pSuper362,398,432,789,903表达载体和pSuper空白载体分别转染Hela细胞,经抗性药物筛选获得抗性细胞克隆和池克隆;通过RT-PCR及荧光定量PCR鉴定阳性克隆,进行平板克隆集落形成试验,以检测打靶序列沉寂LCRG1基因mRNA表达水平的效果.结果:应用PCR定点突变技术改造的pSuper载体,可被BglⅡ酶切;利用RT-PCR和荧光定量PCR检测各重组载体转染细胞池克隆LCRG1 mRNA的表达发现,362组,398组,432组的基因均能封闭内源性LCRG1基因表达,尤以362组为显著;鉴定362组筛选的各个抗性克隆,发现A2和A5克隆的LCRG1 mRNA表达水平明显降低.平板克隆实验结果提示362组的A2,A5和池克隆的细胞增殖能力明显强于载体和空白对照组(P<0.05).结论:成功改建了pSuper真核表达载体;362 siRNA相对其他siRNA具有较好的打靶效果,这对于应用RNAi方法研究LCRG1基因的功能和其作用分子机制具有重要的指导意义.【总页数】8页(P468-475)【作者】段朝军;蒋铁斌;李萃;章晓鹏;李茂玉;肖志强;汤参娥;易红;陈主初【作者单位】中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅三医院血液科,长沙,410013;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008【正文语种】中文【中图分类】R739.6【相关文献】1.喉癌相关基因 LCRG1蛋白的细胞亚定位及生物学特性研究 [J], 李友军;关勇军;谢海龙;陈主初;何春梅;段朝军2.常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及ADAMs相关基因的免疫筛选与序列分析 [J], 林俊堂;李玉昌;张会勇;徐存拴3.大菱鲆脾脏cDNA文库构建、EST序列分析与免疫抗病相关基因的筛选 [J], 孟亮;陈松林;刘洋4.92. 喉癌相关基因LCRG1的鉴定和功能初步研究 [J], 陈主初; 李友军; 谢海龙;何春梅5.一个新的家兔高脂血症相关基因的筛选、克隆和序列分析 [J], 李晓宇;白小明;郭冬平;潘超;孙屏;何龙;范乐明;陈琪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
GLI1基因调控及其在喉癌发生发展中作用机制研究
GLI1基因调控及其在喉癌发生发展中作用机制研究喉癌是指发生在喉部的恶性肿瘤，常见于声带局部，是一种常见的头颈部恶性肿瘤。
GLI1基因是GLI家族（GLI1、GLI2和GLI3）中的一员，该家族在胚胎发育中起着关键的调控作用。
研究发现，GLI1基因在肿瘤发生和发展中也发挥着重要的作用。
本文将就GLI1基因在喉癌发生发展中的作用机制进行研究。
首先，在喉癌组织中，GLI1基因的表达水平明显上调。
GLI1基因是GLI转录因子家族中的主要成员，可以通过调控多个生长因子以及Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog和TGF-β等信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、转移和耐药等过程。
研究发现，在喉癌组织中，GLI1基因的高表达与肿瘤的分级和预后密切相关。
因此，GLI1基因可能作为一个潜在的治疗靶点，对于喉癌的治疗具有重要意义。
其次，在喉癌组织中，GLI1基因的上调与Hedgehog信号通路的激活密切相关。
Hedgehog信号通路是一条重要的细胞增殖和发育调控通路，在胚胎发育中起着重要作用。
研究发现，喉癌组织中Hedgehog信号通路成员的表达水平也明显上调。
GLI1基因作为Hedgehog信号通路的底层效应器，在喉癌中起着至关重要的作用。
研究显示，抑制Hedgehog信号通路或降低GLI1基因的表达可以抑制喉癌细胞的增殖和侵袭能力。
因此，Hedgehog-GLI1信号通路可能成为喉癌治疗的新靶点。
此外，GLI1基因在喉癌的放化疗抵抗中也发挥着重要的作用。
放化疗是喉癌的主要治疗手段，然而患者对放化疗的耐药性往往导致治疗失败。
研究发现，GLI1基因的上调可以增加喉癌细胞对放化疗的耐受性。
此外，GLI1基因还可以通过调节DNA损伤修复和细胞凋亡逃逸等途径，参与喉癌对放化疗的抵抗。
因此，针对GLI1基因的干预可能有助于克服喉癌对放化疗的耐药性。
综上所述，GLI1基因在喉癌发生发展中扮演着重要的角色。
通过调控多个生长因子和信号通路，GLI1基因促进了喉癌细胞的增殖、转移和耐药性。
喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测
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《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识(2024版)》要点
《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识（2024版）》要点1 DNA甲基化标志物概述DNA甲基化是一种DNA的共价修饰，具体是指DNA甲基转移酶（DNMTs）将甲基加到DNA CpG序列中胞嘧啶的5'碳位，形成5-甲基胞嘧啶的过程。
与传统的肿瘤标志物相比，DNA甲基化标志物具有更早期、更无创、更精准等优点。
因此，可以通过非侵入性方式获得的痰液、血浆、血清或尿液等样本进行DNA甲基化标志物检测。
一些DNA甲基化异常发生在肿瘤形成的初始阶段，通过检测与肿瘤发展相关的甲基化标志物，可以辅助癌症早期诊断、评估进展风险。
DNA甲基化标志物甲基化水平的增加或降低与肿瘤预后密切相关，可用于治疗或根治性手术后评估肿瘤微小残留病灶（MRD）和监测复发。
此外，DNA甲基化标志物还可作为化疗敏感性的标志，某些特定基因的甲基化可能预示着癌症对治疗的反应，可用于判断化疗药物的疗效，以更好地指导治疗方案。
2 DNA甲基化标志物的临床检测2.1 临床样本前处理注意事项细胞基因组与游离DNA（cfDNA）均可用于肿瘤DNA甲基化检测，常采用组织、血液样本，也可采用尿液、浆膜腔积液、灌洗液、粪便、拭子等样本。
专家共识：各类样本经采集后，应尽可能减少转运环节与耗时，及早分离检测组分。
血液样本应避免溶血，不可使用肝素抗凝。
检测游离DNA时，采集量应充足，及早采用两步离心法分离无细胞血浆，分离前不可对含红细胞血样进行冻存。
新鲜体液及灌洗液样本如含较多血液成分可进行抗凝处理。
粪便样本推荐采用含防腐剂保存液。
（推荐等级：强推荐）2.2 DNA甲基化标志物检测技术方法2.2.1 DNA提取与纯化2.2.2 DNA转化2.2.3 DNA甲基化检测平台专家共识：抽提纯化所得DNA应根据样本类型制定质量合格标准并进行评价，包括浓度、纯度和DNA完整性。
cfDNA还应评估片段分布，以排除基因组DNA污染。
DNA甲基化检测需要针对不同的标本类型与检测应用选择适宜的转化方法，并关注转化技术的最新进展。
喉鳞癌Apaf-1基因表达及启动子区甲基化研究
瘤耐药及产生化 疗、 放疗副作用的重要原因 因异常， 如 &’(): 、 &!* ， "I< 等表达异常
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甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC—1基因表达的影响
甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC—1基因表达的影响摘要：肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-l，DLC-1）在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调，这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases.DNMTs）参与的启动子区异常甲基化有关。
RT-PCR结果显示DLC-I在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。
甲基化特异性PCR（methylation-specifiC PCR，MSPCR）结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化，而干扰DNMTs后5-8F细胞中DLC-l启动子区甲基化状态被逆转，其中特异性干扰DNMT1后效果略为显著，提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用，而DNMT1的调控作用更为突出。
关键词：DNA甲基转移酶（DNMTs）；肝癌缺失基因-1（DLC-1）；甲基化；RNA干扰DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基添加在DNA分子中CpG二核苷酸的胞嘧啶碱基上。
在哺乳动物中，甲基化转移酶主要有4个成员，即DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。
DNMT1主要在DNA复制和修复中维持其甲基化，而DNMT3则是从头合成甲基化酶，使得原来没有甲基化的DNA甲基化，包含了DNMT3A、DNMT3B和一个调节蛋白DNMT3L，对于富含CpG片段的DNA，DNMT3A甲基化效率不高，但是它显示出比其他甲基化酶更高的准确性，有文献证明DNMT3A与单拷贝基因的甲基化有关。
相反，DNMT3B却能快速甲基化富含CpG的片段，而DNMT3L因缺乏起催化作用的亚基，因而其本身并不具备甲基化酶活性，但能作为调节蛋白，协助DNMT3A和DNMT3B，共同进行甲基化作用。
survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达
Ｍｏｅｕａ ｌｎｎ ｆｔｅｓｒｉｎｇｎ ｒｍｏｅ ｎ ｓｓｅｉｃｅｐｅｓ ｎ ｌ ｌｒｃ ｉｇｏ ｕｖ ｉ ｅｅｐｏ ｔｒａ ｄｉ ｃｆ ｘ ｒｓｏ ｃ ｏ ｈ ｖ ｔ ｐ ｉ ｉ ｍ ｔｅｈ ｍａ ｙｇａ ｎ ｅ ｅ － ｅ ｎ ． ｈ ｕ ｎｌｒｎｅｌ ａ ｃｒＨ ｐ２ｃｌｌ ｅ ａ ｃ ｌｉ
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论
著 ・
ｓｒｉｎ基 因 启动 子 的 克 隆 及 其 在 ｕｖ ｉ ｖ 人 喉 癌 Ｈｅ 一 胞 中 的特 异 性 表 达 ｐ２细
白万胜 成诗银 王军利 ， 卞 卡 张 惠中 ， ， ，
（ 四军 医 大学唐 都 医院 ，． 鼻咽喉 科 ； ． 第 １耳 ２ 临床实 验科 ， 西西 安 ７０ ３ ） 陕 １０ ８
喉癌组织中LCRG1的表达及其临床意义
摘要：目的 探讨喉癌相关基 因 １（ｌａｒｙｎｇｅａｌｃａｎｃｅｒｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ１，ＬＣＲＧ１）在喉鳞状细胞癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌｓｑｕｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒ ｃｉｎｏｍａ，ＬＳＣＣ）中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用免疫组化 ＳＰ法对 ８９例 ＬＳＣＣ、３１例喉上皮内瘤变及 １０例喉部息肉进行检测，观察 ＬＣＲＧ１蛋白的表达。分析 ＬＣＲＧ１的表达与 ＬＳＣＣ患者性别、年龄、临床分型、组织学类 型、ＴＮＭ 分 期、肿 瘤 大 小、淋 巴 结 转 移 的 关 系。 结 果 ＬＣＲＧ１在 ＬＳＣＣ中的阳性率为 ７８６５％，低于上皮内瘤变组 织和喉部息肉组 织 （Ｐ＜００５），随 着 组 织 分 化 程 度 的 增 高， 阳性率明显增高 （Ｐ＜００５）；与 患 者 性 别、年 龄、临 床 分 型、 ＴＮＭ分期、肿瘤大小、淋巴结转移无关。结论 ＬＣＲＧ１蛋白 在喉癌中表达的降低可能与癌变的发生有关，其表达与组织 学分级相关。 关键词：喉肿瘤；ＬＣＲＧ１基因；免疫组织化学；ＴＮＭ分期 中图分类号：Ｒ７３９６５ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００１－７３９９（２０１９）０７－０８５６－０３ ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１９．０７．０２７
期 ２６例；年龄 ２８～８５岁，其中 ＜５５岁患者 ２４例，≥５５岁者 ６５例；其中男性 ８５例，女性 ４例；声门型 ８４例，声门上型 ５ 例；肿瘤直径 ＜３ｃｍ者 ６４例，≥３ｃｍ者 ２５例；有颈部淋巴 结转移者 １５例，无颈部淋巴结转移者 ７４例；高分化 ５５例， 中分化 ２９例，低分化 ５例；另选取喉部黏膜病理诊断为上皮 内瘤变 ３１例、喉部息肉 １０例。患者术前均未行放、化疗，均 签署相关知情同意书，符合医学伦理学规定。 １．２ 方法 所有标本均经 １０％中性福尔马林固定，常规石 蜡包埋。ＬＣＲＧ１单 克 隆 抗 体 购 自 上 海 锐 劲 生 物 公 司，即 用 型第二代免疫 组 化 广 谱 试 剂 盒、ＤＡＢ显 色 试 剂 盒 均 购 于 福 州迈新生物公司，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，用已 知阳性切片作为对照，用 ＰＢＳ代替一抗作为空白对照。 １．３ 结果判读 免疫组化染色结果由两位病理医师采用双 盲法独立判断。光镜下每张切片选取 ３个典型区域在 ４００ 倍光镜下计数肿瘤组织中的阳性细胞数，取结果的平均值。 ＬＣＲＧ１表达定位 于 细 胞 核，呈 棕 黄 色。 参 照 李 晓 杰 等 ［３］标 准，按阳性细胞 数 判 断：无 阳 性 细 胞 数 为 （－），阳 性 细 胞 数 ＜２５％为（＋），２６％ ～５０％为（），＞５０％为（）。 １．４ 统计学分析 采用 ＳＰＳＳ２１０软件进行统计学分析， 计数资料以百分 率 （％）表 示，多 组 间 比 较 采 用 多 个 独 立 样 本比较 ＫｒｕｓｋａｌＷａｌｌｉｓＨ检验，以 Ｐ＜００５为差异有统计学 意义。两组比较采用秩和检验法（Ｐ值修正法），即 Ｐ＜００５ 为差异有统计学意义。
喉鳞癌组织中SMG-1、ATM和P53的表达及临床意义
喉鳞癌组织中SMG-1、ATM和P53的表达及临床意义周学军;王晓凤;冯勇军;谢民强【摘要】目的检测SMG-1、ATM和P53在喉鳞癌组织中的表达,探讨它们在肿瘤发生发展过程中的相互作用.方法收集2006年1月1日～2009年8月31日在耳鼻咽喉科住院手术的喉鳞癌患者标本,采用免疫组化法检测63例喉鳞癌、30例癌旁正常组织中SMG-1、ATM和P53蛋白的表达情况,并对它们的表达与喉癌临床病理特征之间的关系以及三者的相关性进行分析.结果 SMG-1、ATM和P53在喉鳞癌组中的表达率分别为36.5％(23/63)、41.3％(26/63)、和57.1％(36/63),与癌旁正常组织比较(分别为73.3％、83.3％、和20.0％),差异有统计学意义(P＜0.05);SMG-1表达与T分期和原发部位呈显著相关(P＜0.05),与患者年龄、N分期、病理分级无关(P＞0.05).ATM和P53表达均与患者年龄、T分期、N分期、原发部位、病理分级无关(P＞0.05).SMG-1阴性表达患者的五年生存率明显高于阳性患者,差异有统计学意义(P＜0.05).SMG-1和P53的表达之间存在负相关关系(r=-0.476,P＜0.01).结论 SMG-1、ATM和P53与喉癌的发生关系密切,SMG-1表达是反映喉癌临床病理特征和预后的重要生物学指标,其可能通过调控P53表达,共同在喉癌的发生发展中起重要作用.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】6页(P50-55)【关键词】生殖器形成抑制基因-1;毛细血管扩张突变基因;P53;喉癌;预后【作者】周学军;王晓凤;冯勇军;谢民强【作者单位】南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉科,广东广州510280;海南医学院附属医院耳鼻咽喉科,海南海口570102;海南医学院附属医院耳鼻咽喉科,海南海口570102;海南省农垦总局医院耳鼻咽喉科,海南海口570311;南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉科,广东广州510280【正文语种】中文喉癌是严重影响人类健康的疾病之一，在过去的十年间，喉癌的外科治疗技术不断更新，多种治疗方式不断改进，使得喉癌患者的喉功能保存率及生存质量获得不断提高。
喉鳞状细胞癌组织CLDN11基因启动子甲基化及临床意义研究
浙江医学2018年第40卷第5期喉癌是呼吸系统常见恶性肿瘤之一，其发病率居呼吸系统恶性肿瘤的第2位，仅次于肺癌[1]；国人发病率有明显上升趋势，且发病年龄趋于年轻化，尤其在北方地区[2]。
喉鳞状细胞癌（LSCC ）是喉癌最常见的病理类型。
喉癌的发生包括遗传学和表观遗传学两大机制，以及吸烟、饮酒过度、病毒感染等因素的参与[3]。
目前认为，以抑癌基因启动子异常甲基化（会导致基因沉默或失活）为代表的表观遗传学改变是肿瘤发生的重要机制之一，检测肿瘤相关基因启动子异常甲基化已逐步成为早期筛查肿瘤的常用方法[4-5]。
人类CLDN11基因定位于3q26.2，其编码的Claudin-11蛋白是完整的膜蛋白，为组成细胞紧密连接的主要成分，而紧密连接蛋白的异常表达被认为是肿瘤进展的重要一步[6]。
CLDN11基因表达下调会增强肿瘤细胞迁移、侵袭能力，进而促进肿瘤发生、发曹炳沈志森林乐希郝文娟周重昌doi ：10.12056/j.issn.1006-2785.2018.40.5.2017-2263基金项目：浙江省自然科学基金（LY14H160003）；浙江省医药卫生省部培育计划（2014PYA017）；浙江省医药卫生科技计划项目（2012ZDA042）；宁波市科技创新团队（2012B82019、2015B11050）；宁波市重大择优委托项目（2012C5015）；宁波市自然科学基金（2012A610208、2017A610236）作者单位：315000宁波大学医学院（曹炳、林乐希、郝文娟）；宁波大学附属李惠利医院耳鼻咽喉头颈外科（沈志森、周重昌）通信作者：沈志森，E-mail:szs7216@喉鳞状细胞癌组织CLDN11基因启动子甲基化及临床意义研究【摘要】目的探讨喉鳞状细胞癌（LSCC ）组织中CLDN11基因启动子的甲基化水平及其临床意义。
方法采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应（qMSP ）分别检测91例LSCC 患者的LSCC 组织及其配对的癌旁正常组织CLDN11基因启动子甲基化水平，分析其与临床病理特征及预后的关系，绘制ROC 曲线评估其诊断价值。
miR-181d靶向LCRG1调控喉癌细胞Hep2增殖与迁移的机制
（２０１８ＪＪ２３３８） 作者单位：１南华大学肿瘤研究所，衡阳 ４２１００１
２南华大学附属南华医院病理科，衡阳 ４２１００１ 作者简介：赵 娟 霞，女，硕 士 研 究 生。Ｔｅｌ：（０７３４）８３５８０７１，Ｅｍａｉｌ：
·９４８·
临床与实验病理学杂志 ＪＣｌｉｎＥｘｐＰａｔｈｏｌ ２０１８Ｓｅｐ；３４（９）
网络出版时间：２０１８－９－２５１０：１１ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０１８０９２５．１０１１．００２．ｈｔｍｌ
·论 著·
ｍｉＲ１８１ｄ靶向 ＬＣＲＧ１调控喉癌细胞 Ｈｅｐ２增殖与迁移 的机制
赵娟霞１，２，龚 勇１，杨淑梅１，伍甜田１，夏昱琴１，谢海龙１
摘要：目的 探讨 ｍｉＲ１８１ｄ对 ＬＣＲＧ１的调控作用及 ｍｉＲ１８１ｄ对喉癌 Ｈｅｐ２细胞增殖的影响。方法 利用基因芯片和 ＲＴ ＰＣＲ技术检测 ｍｉＲ１８１ｄ在喉癌组织和癌旁组织中的表达；生物信息学预测喉癌候选抑瘤基因 ＬＣＲＧ１的靶标 ｍｉＲＮＡｓ；构建 ＬＣＲＧ１３′ＵＴＲ荧光素酶载体，双荧光素酶检测系统测定其荧光素酶活性；将 ｍｉＲ１８１ｄｍｉｍｉｃ和 ｍｉＲ１８１ｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒ瞬转入 Ｈｅｐ２ 细胞，ＲＴＰＣＲ结果验证 ｍｉＲ１８１ｄ的表达后，再用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组中 ＬＣＲＧ１蛋白的表达；采用 ＭＴＴ实验、迁移、侵袭 及流式细胞术等实验，观察转染组与对照组细胞的增殖。结果 ｍｉＲ１８１ｄ在喉癌组织中的表达量较癌旁组织明显升高（Ｐ＝ ００４６５）；ｍｉＲ１８１ｄ可能靶向结合 ＬＣＲＧ１，且 ＬＣＲＧ１蛋白表达与 ｍｉＲ１８１ｄ表达呈负相关；下调 ｍｉＲ１８１ｄ能降低 Ｈｅｐ２细胞的 增殖、迁移、侵袭能力，并使细胞周期主要阻滞于 Ｇ１ 期。结论 在 Ｈｅｐ２细胞中 ｍｉＲ１８１ｄ可以结合 ＬＣＲＧ１３′ＵＴＲ，负性调控 ＬＣＲＧ１的表达并使 Ｈｅｐ２细胞增殖、迁移和侵袭能力增强。 关键词：喉肿瘤；ｍｉＲ１８１ｄ；ＬＣＲＧ１ 中图分类号：Ｒ７３９６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－７３９９（２０１８）０９－０９４８－０５ ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１８．０９．００２
DNA修复基因ERCC1启动子区甲基化与胶质瘤放射敏感性的相关性研究
DNA修复基因ERCC1启动子区甲基化与胶质瘤放射敏感性的相关性研究刘志刚;陈华云;夏云飞;关皑丽;陈忠平【期刊名称】《中国神经肿瘤杂志》【年(卷),期】2007(5)3【摘要】背景与目的:胶质瘤的放射治疗效果与其放射敏感性密切相关,有许多因素影响着胶质瘤的放射敏感性.研究已经发现某些基因启动子区CpG岛的甲基化会导致基因的表达沉默,从而影响肿瘤放射敏感性.本文初步探讨了DNA修复基因ERCC1启动子区CpG甲基化与脑胶质瘤放射敏感性的关系.方法:培养4种胶质瘤细胞株MGR1、MGR2、SF767、T98G,集落形成实验法检测其放射敏感性,以2Gy照射后细胞存活集落数(SF2)作为标准表示.应用亚硫酸氢钠修饰后测序的方法对4株细胞中ERCC1基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行分析.进而分析其甲基化状态与放射敏感性的关系.结果:4种胶质瘤细胞株的放射敏感性存在较大差异,SF2均数范围从0.18到0.70;在ERCC1启动子区CpG为去甲基化状态细胞株的SF2值较高(MGR1,0.59±0.09;T98G,0.70±0.05),表示对放射线较抗拒;ERCC1启动子区CpG为甲基化状态细胞株的SF2值较低(MGR2,0.18±0.05;SF767,0.32±0.08),表示对放射线较敏感(t=-4.43,P＜0.05).结论:ERCC1启动子区CpG甲基化状态可能与胶质瘤细胞株放射敏感性相关,有希望成为预测胶质瘤放疗敏感性的新指标.【总页数】4页(P156-159)【作者】刘志刚;陈华云;夏云飞;关皑丽;陈忠平【作者单位】中山大学肿瘤防治中心放射治疗科/放射生物学实验室,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,广东,广州,510060;中山大学肿瘤防治中心神经外科/神经肿瘤研究室,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,广东,广州,510060;中山大学肿瘤防治中心放射治疗科/放射生物学实验室,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,广东,广州,510060;台湾高雄医学大学附设中和纪念医院神经外科,台湾,80708;中山大学肿瘤防治中心神经外科/神经肿瘤研究室,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,广东,广州,510060【正文语种】中文【中图分类】R739.41【相关文献】1.DNA修复酶基因MGMT启动子区异常甲基化与食管癌的关系 [J], 肖志平;刘冉;许婧;尹立红;浦跃朴;王仪;潘恩春;张学艳2.胶质瘤细胞株中ERCC1、ERCC2基因启动子区CpG岛的甲基化分析 [J], 陈华云;张俊英;陈忠平3.胶质瘤组织中DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化研究 [J], 王之敏;高薇;朱凤清;许期年;左剑玲;王秀云;周岱4.DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化与脑胶质瘤 [J], 高薇;王之敏;周岱;朱凤清5.脑胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶(IDH)1/2基因突变与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子区甲基化的相关性研究 [J], 林华亮;郑泽洲;郑伟杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测李金花;曾龙武;谢海龙【摘要】目的观察喉癌候选抑瘤基因(laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)启动子的功能.方法 (1)通过5′-缺失突变、瞬时转染与荧光素酶报告基因活性检测,进一步分析与LCRG1基因表达调控有关的最小启动子区域;(2)通过PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因启动子突变;(3)应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因启动子甲基化状态;(4)采用RT-PCR技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因的表达.结果(1)LCRG1基因最小启动子片段位于转录起始位点上游-169~-57位点;(2)喉癌组织中LCRG1基因启动子无突变;(3)40例喉癌组织中有5.00% LCRG1基因启动子甲基化改变;(4)RT-PCR检测显示40%(16/40)喉癌组织中LCRG1基因表达下调.结论 LCRG1基因最小启动子位于转录起始位点上游-169~-57位点的DNA片段;LCRG1基因启动子甲基化部分改变可能参与该基因的表达调控.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)008【总页数】6页(P819-824)【关键词】转录调控;最小启动子;瞬时转染;甲基化【作者】李金花;曾龙武;谢海龙【作者单位】杭州师范大学附属医院病理科,杭州310015;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000【正文语种】中文【中图分类】R739.65喉癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发生、发展过程复杂，涉及大量相关基因结构和表达调控的改变，瘤基因的激活和抑瘤基因的失活起到关键性作用，喉癌的发病分子机制至今仍未清楚[1]。
因此，分离和鉴定与喉癌发病相关的基因是阐明其癌变机制与易感性的关键，对临床诊断与治疗也有较为重要的意义。
喉癌的杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)研究显示，在染色体 3p、8p、9p、13q、17p、17q上均有较高频率的 LOH[2，3]。
喉癌候选抑瘤基因(laryngeal carcinoma related gene 1，LCRG1)是喉癌中表达下调的新基因，定位于17q12～21.1上，位于D17S800～D17S930之间，正好位于17q21.1上的LOH的高频区域[4]。
研究显示，LCRG1在54.5%(6/11)的其它肿瘤细胞系中不表达[4]，当将野生型LCRG1 cDNA编码区导入到不表达该基因的喉癌细胞系Hep-2中，见其明显抑制细胞生长、Hep-2细胞的停泊非依赖性生长及抑制裸鼠成瘤[5]，这表明LCRG1具有一定的抑瘤功能。
然而，LCRG1在肿瘤尤其是在喉癌中的缺失或低表达的转录调控机制至今尚未清楚[6]。
课题组在既往的研究中已初步确定LCRG1基因的启动子片段及启动子区域内部分关键顺式调节元件[7－9]。
本研究从转录调控机制入手，应用多种实验方法对LCRG1基因启动子的表达调控机制进行研究，进一步提高该基因的认识和促进其功能研究的开展，了解该基因在喉癌中表达下调的分子机制。
1 材料与方法1.1 材料收集2005年1月～2008年6月南华大学附属第二医院和南华大学郴州市第一人民医院教学医院手术切除的喉癌根治术标本(所有标本均经患者及院方许可)40例，其中男性29例，女性11例，年龄52～72岁，中位年龄61岁。
40例喉癌组织中高分化18例，中分化9例，低分化13例。
早期喉癌(TNM分类0～Ⅰ期)6例，进展期喉癌(TNM分类Ⅱ～Ⅳ期)34例，有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者11例。
所有患者术前均未接受放、化疗。
COS7细胞株购自美国ATCC公司、人肝癌细胞7721来自南华大学肿瘤研究;DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司;用于启动子活性分析的PGL3系列质粒及荧光素酶内参照质粒PRL-TK购自Promega公司。
DNA转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;双荧光素酶检测试剂购自Promega公司;质粒提取试剂盒购自Qiagen公司;各种限制性内切酶、DNA连接酶、胶纯化回收试剂盒均购自Takara公司;实验中所用引物均用Primer Premier 3.0软件设计，由上海英骏公司合成。
EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒购自美国Zymo Research公司。
1.2 方法1.2.1 重组质粒的构建载体质粒pGL3-basic不含启动子和增强子，含萤火虫荧光素酶报告基因，重组体中所含启动子即是所要研究的LCRG1的5'端启动子片段。
6个构建的重组体分别命名为pGL3-E177(－169～ +8 bp)、pGL3-E112(－169～－57 bp)、pGL3-E89(－169～－78 bp)、pGL3-E88(－78～ +8 bp)、pGL3-E96(－57～ +39 bp)、pGL3-E180(－53～+127 bp)。
PCR扩增以pGL3-E296质粒为模板[6]，利用PCR技术将不同长度的启动子片段扩增出来，上、下游引物的5'端分别引入MluⅠ和XhoⅠ酶切位点。
扩增片段用MluⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到同样被这两种酶酶切的pGL3-basic载体中的多克隆位点内，构建含LCRG1 5'调控序列和萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒。
重组质粒经酶切和测序进一步鉴定。
构建的重组质粒和相对应的引物见表1。
另外重组体pGL3-E180(－53～+127 bp)的构建是将pGL3-E296用MluⅠ和NarⅠ双酶切消化后，加Klenow酶、dNTPs补平，电泳回收纯化载体大片段，用T4 DNA连接酶自连载体大片段，转化TOP10感受态菌，挑取转化子，抽质粒后用KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，产物中有约210 bp片段的为正确转化子，测序结果正确;重组体pGL3-E89(－169～－78 bp)是将全长pGL3-E177质粒分别用NruⅠ和XhoⅠ酶切消化后，Klenow酶补平，电泳回收并纯化含载体的大片段(约5 K)。
自连转化DH10B感受态菌，挑取转化子，抽质粒ScaⅠ酶切鉴定，测序结果正确;重组体pGL3-E88(－78～+8 bp)是将全长pGL3-E177质粒分别用NruⅠ和MluⅠ酶切消化后，Klenow酶补平，电泳回收并纯化含载体的大片段(约5 K)。
自连转化DH10B感受态菌，挑取转化子，抽质粒ScaⅠ酶切鉴定，测序结果正确。
表1 相关引物序列引物序列(5'-3') 产物长度(bp)E112 LCGACGCGTGGGCCCACGGGCGG 112 R CCGCTCGAGGGCGGGACCCACG E96 LCGACGCGTCGGCGCCCGACCCC 96 R CCGCTCGAGTTTCCTCTACGGGCAGTC E177 LACGCGTCGGGCCCACGGGCGGGACGG 177 RCTCGAGGCGGGGAGTGGAAGAAGGAG1.2.2 瞬时转染质粒转染按Lipofectamine 2000使用说明进行。
转染前一天，将COS7、7721细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔组织培养板，当细胞生长至80% ～90%融合时，加入0.4 μg重组质粒、20 ng 的 PRL-CMV 及0.75 μl Lipofectamine 2000。
同时设立转染 pGL3-basic阴性对照组和pGL3-control 阳性对照组。
1.2.3 荧光素酶报告基因活性检测根据Promega公司Dual-Luciferase ReporterAssay Kit提供的操作步骤检测报告基因活性。
具体操作如下:每孔加入100 μl× PassiveLysis Buffer，室温裂解 10 min，用枪头刮下细胞后收集到1.5 ml Eppendorf管中，13 200 r/min×2，取20 μl上清加入测量管中，先加入Fire-fly Luciferase 底物30 μl，用 MiniLumat LB 9506(EG＆G ERTHOLD)仪器测量并记录读数，然后在该反应混合物中加入30 μl Renilla Luciferase底物，测量并记录读数。
以Firefly Luciferase读数与Renilla Luciferase读数比值(Ratio)作为相对Luciferase活性，即Relative Luciferase Activity，各缺失插入片段启动子活性均通过与阳性对照质粒pGL3-control比较(以pGL3-control启动子活性为100%)获得。
为减少误差，各实验至少重复3次，每次实验均设2个平行组，Mean表示两组的Ratio平均值。
标准偏差计算公式为1.2.4 组织DNA与RNA提取按《分子克隆实验指南》操作步骤提取细胞和组织标本的基因组DNA与RNA。
1.2.5 PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP) 利用Primer 3.0软件设计引物扩增LCRG1启动子区域，LCRG1-SSCP-F:5'-CCCTCCTACCAGTCCTAGTTCG-3'和LCRG1-SSCP-R:5'-CGTTTCCTCTACGGGCAGTC-3'。
以基因组DNA 0.5 μg为模板进行PCR反应，取PCR产物处理后电泳，回收电泳缓冲液，银染后的凝胶经凝胶成像系统成像、拍摄，电脑保存。
1.2.6 甲基化特异性 PCR(methylation specific PCR，MSP)DNA甲基化处理采用美国Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒。
LCRG1启动子区域包括一个CpG岛，即从转录起始位点上游－169 bp到－58 bp。
利用Methyl Primer Express Software v1.0和Primer 3.0软件设计两对引物，(1)LCRG1-BSP1-F:5'-GGTTGGGGTTTGAGG TTG-3'，LCRG1-BSP1-R:5'-AACTCCCACCTCTACTC CCTATTACTA-3';(2)LCRG1-BSP2-F:5'-TTTTTTTA TTAGTTTTAGTTTGGGTTTAG-3'，LCRG1-BSP2-R:5'-TTTCCTCTACAAACAATCAACCAC-3'。