第二章 分子克隆工具酶
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基因工程复习资料
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
7(2011)第7讲 分子克隆工具酶9.13
二
其他分子克隆工具酶
（一）DNA聚合酶(DNA polymerase)
1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段） （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 特性：具有3种酶活性
聚合酶功能 3’
5’ 5’ 外切功能
3’外切功能
a.5’3’DNA聚合酶活性 底物：单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物
MboⅠ▼ GATC
• 【同尾酶】
(isocaudarner):不同来 源的限制性核酸内切酶 识别与切割的核苷酸靶 序列各不相同，但都产
生相同的粘性末端，这
类酶称为同尾酶。 BamHI(GGATCC))和 BglⅡ(AGATCT)。
当一种限制性内切酶在一个特异性的碱 基序列处切断DNA时，就可在切口处留 下几个未配对的核苷酸片段，即5’突出。 这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢 键相连，或者通过分子内反应环化。因 此称这些片断具有粘性，叫做粘性末端
2.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) （1）Klenow酶的基本性质：
• 【Klenow酶】大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋
白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。
• Klenow酶仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5` 的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶 活性。
3.限制性核酸内切酶的分类 • 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及 是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ辅助因子 识别序列
Ⅰ型
多功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处
Ⅱ型
单功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列
Ⅲ型
双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
第二章 分子克隆工具酶3.8
1962年W. Arber提出,菌体中含有2种以上功能 不同的酶：
1. 核酸内切酶：能识别切断外来DNA分子的某 些部位，使其使去活性，限制外来只菌体的繁 殖——限制性核酸内切酶；菌体的防御系统。
2. 修饰酶：也能识别限制性内切酶所识别的 序列，并把某些 C 或 A 甲基化，使其不被 RE 降 解——菌体保护自身DNA系统。
(2)同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其 识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产
生相同的黏性末端，例如BamH I(GGATCC)。同
尾酶产生的DNA片段能通过黏性末端之间的互
补作用而彼此连接起来，但重组后形成的序列
再也不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
同尾酶
Sau3A I GATC CTAG BamH I GGATCC CCTAGG
4.切割后产生平头或黏性末端。
5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。
Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口
1. 平头末端 (blunt end) 即在识别序列的对 称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列为5’GGCC-3’，其切点在G与C之间； 2.黏性末端(cohesive end) 即在识别序列的 两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链 尾巴的切口。黏性末端又可分为两种：从DNA 分子5’端切割产生5’端突出的黏性末端称为 5’黏性末端．如EcoRI；从3’端切割产生3’ 端突出的黏性末端称为3’黏性末端，如Pst I。
第三节
DNA 聚 合 酶
DNA聚合酶
(DNA polymerase)
在细胞内的DNA复制过程中起着重要的作用。 它们通常被分为DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ三类。 DNA聚合酶I是基因工程中最常用的工具酶。 基因工程中常用的DNA聚合酶有： 大肠杆菌聚合酶I(全酶)；
基因工程复习总结
思考题
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
第三章分子克隆载体
1.基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制；
有一定的选择标记，易于识别和筛选；
有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源，而不影响其本身的复制;
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。
2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链;
选择标记基因；
合适的限制酶位点。
引物有哪些基本要求？
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1μM，即1μl，在100μl反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1的片段，可得到3.3μg的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度：至少16，通常为18-30，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。
第五章表达载体
····1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？
2.简述利用T7噬菌体启动子的系列表达载体的工作原理。
····3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？
···4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？
4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？
黏粒的优点
（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
第三章分子克隆载体
1.基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制；
有一定的选择标记，易于识别和筛选；
有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源，而不影响其本身的复制;
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。
2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链;
选择标记基因；
合适的限制酶位点。
引物有哪些基本要求？
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1μM，即1μl，在100μl反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1的片段，可得到3.3μg的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度：至少16，通常为18-30，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。
第五章表达载体
····1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？
2.简述利用T7噬菌体启动子的系列表达载体的工作原理。
····3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？
···4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？
4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？
黏粒的优点
（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)
噬菌体T4DNA连接酶
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为 60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性 末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌 DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶那么无 效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶 都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2) 反响系统因素
缓冲液〔无菌、无污染〕 buffer 〔pH=8.0〕 ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2
1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
〔DDT：二硫苏糖醇 BSA： 牛血清蛋白)
NaCL〔0, 500, 1000mM〕
金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，假设以Mn2+代 替Mg2+〔如HindⅢ，ECORI〕那么特异性改
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质 粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点〔识别切割位点为 G↓TCGAC〕，该位点也可被 AccⅠ〔识别切割位点为 GT↓MKAC〕和 HincⅡ〔识别切割位点为 GTY↓RAC〕切割。
(3) 同尾酶
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些 酶称为同尾酶〔isocaudamer)
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量〕和大肠 杆菌DNA连接酶〔NAD+提供能量〕两 种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。 对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍 具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反响形 成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。
第二章 (用)分子克隆工具酶
W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
基因工程学习资料
Dra III
Ear I
同裂酶（isoschizomer)
• 指来源不同但具有相同识别序列的一类限制酶，但其切割位点可能不同。 • 可分为如下几种情况： 1 ） 同 序 同 切 酶 ， 如 BamH I 和 BstY I 具 有 相 同 的 识 别 切 割 位 点 G↓GATCC； 2）同序异切酶，如Kpn I（GGTAC↓C）和Acc65 I（G↓GTACC）； 3 ） 识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶识别序列，如 EcoR I （ G↓AATTC ）和 Apo I （ R↓AATTY ）、 Sal I （ G↓TCGAC ）和 Acc I （GT↓MKAC）、Hinc II（GTY↓RAC）。
H.O.Smith and D.Nathans(1973)年提议的命名系统 • 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母的略 语表示寄主菌的物种名。 如：Escherichia coli 用Eco表示。 • 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，如：EcoR。 • 以罗马字母表示同一菌株中不同的限制和修饰体系。如： EcoRI 和EcoRV （EcoR I, EcoR V)。 • 例：Hind III 表示为从流感嗜血菌Rd 菌株（Haemophilus influenzae Rd）中分离到的第三种限制性内切酶。
2.1.9.3 酶量
• 根据酶的活性和DNA底物的量、反应时间而定。 限制性核酸内切酶活性单位定义： 在最适反应条件下，60分钟内完全切割1μg λDNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） • 容积活性： U/ μl • 与DNA分子上识别位点的密度、位点偏爱有关： 密度大用酶量多；密度小用酶量少。 • 常用酶量：酶和底物比例为2~10U/ μgDNA
识别序列的结构
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
2010-11-8 苏州科技学院生物系 叶亚新
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
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叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
第二章 工具酶.限制酶
第二章 基因克隆的工具酶
第一节 第二节 第三节 第四节 逆转录酶及其它酶
徐师大-屈艾老师制作
1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。 基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。 工具酶是从哪里获得的呢？
徐师大-屈艾老师制作 17
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。 3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。 4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
徐师大-屈艾老师制作 7
l
徐师大-屈艾老师制作
8
徐师大-屈艾老师制作
9
二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性 （7项） I型
II型
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
徐师大-屈艾老师制作
徐师大-屈艾老师制作
21
三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
第一节 第二节 第三节 第四节 逆转录酶及其它酶
徐师大-屈艾老师制作
1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。 基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。 工具酶是从哪里获得的呢？
徐师大-屈艾老师制作 17
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。 3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。 4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
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l
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8
徐师大-屈艾老师制作
9
二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性 （7项） I型
II型
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
徐师大-屈艾老师制作
徐师大-屈艾老师制作
21
三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
基因工程第二章 基因工程工具酶
SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后 ，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412
分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的 腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后 ，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412
分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的 腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
第二章 分子克隆工具酶题目
第二章分子克隆工具酶一、选择题1.有关基因工程的叙述正确的是（）A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过（）。
A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切二、填空题1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5‟突出的黏性末端，则可以用__________进行3‟末端标记。
如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3‟突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3‟末端标记。
2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。
三、判断题1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。
pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。
同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（）四、名词解释1. DNA聚合酶2. 限制性内切酶3. 甲基化酶4. T4-DNA连接酶5. 核酸酶6. Klenow酶7. T4 DNA聚合酶8. Taq DNA聚合酶9. 逆转录酶10. 同裂酶11. 核酶五、简答题1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？3.简述Klenow聚合酶的用途。
4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。
5.限制性内切酶I 的识别序列和切点是——GATCC G ↓，限制性内切酶II 的识别序列和切点是——GATC ↓。
在质粒上有酶I 的1个切点，在目的基因的两侧各有l 个酶II 的切点。
用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA 。
分子克隆常用工具酶
基本用途
植物基因工程
大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment)
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理, 获得N端三分之二的大肽段,即Klenow 酶。
Klenow 酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性 和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→ 3’ 的核酸外切酶活性。
植物基因工程
第一节 分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 子。
植物基因工程
限制性内切酶 Restriction enzymes
2. K1enow片段 3. T4 DNA聚合酶
依赖于DNA的DNA聚合酶
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
植物基因工程
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双 链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针 植物基因工程
冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
植物基因工程
每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 为7bp～8bp，甚或多于 8bp。
多数限制酶的识别序 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 中的磷酸二酯键。
“分子 剪刀”
第2章 分子克隆工具酶
（2）同尾末端的连接。
不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相互连 接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切 位点却消失。 例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ （T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也产生了新的酶切位点
2. 反应温度
大多数为 37℃ ，一部分为 50-65℃ ，少数 2530℃ 高温作用酶在 37℃ 下的活性会下降，多数仅 为最适条件下的 10-50%
3. 反应时间
反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反 应时间可减少酶的用量 EcoRⅠ 若反应 16 小时，所需酶量为正常酶切 时间的 1/8 HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d H i n d III
H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同 则其中一个可用种名的第一和第三个字母。
6. 归位内切酶——I-prefix 和 pI-prefix 系列酶
有些线粒体、叶绿体、核 DNA 、T 偶数噬菌 体含有一些编码内切酶的内含子，有些 intein （protein splicing element） 也有内切酶的活性， 这两类内切核酸酶称为 I-prefix 和 pI-prefix 系 列内切酶，它们识别的序列很长。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和编码的
分子克隆工具酶(1)
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1
体外重组DNA技术所 需的基本条件？
A. 用于核酸操作的工具酶 B .用于基因克隆的载体 C. 用于基因转移的受体菌或细胞
用于核酸操作的工具酶有哪些？
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2
第二章 分子克隆工具酶 Enzymes Used in Molecular
Cloning
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3
在基因工程的实际操作中，工具酶 的使用是一项基本技术。
限制酶是一类能够识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸水解酶。
限制酶存在于细菌中，也存在于一些病 毒中，真核生物中没有限制酶。
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17
一、限制酶的命名与分类
1、命名
1973年H.O. Smith和D. Nathams首次提出命名原则， 1980年Roberts在此基础上进行了系统分类
主要特性
Ⅱ型
Ⅰ型
Ⅲ型
酶分子 内切酶与甲基化酶不在 三亚基双功能酶 二亚基双功能酶
一起
识别位点 4-6bp，多为回文序
二分非对称
5-7bp非对称
列
切割位点 识别序列内或附近特异 无特异性，距识别序 距识别序列下游24-
切割
列1kb外
26bp处
在体外对DNA进行分离纯化、连接 重组或者修饰合成等，都会涉及一 系列酶促反应。
用于基因工程的工具酶种类繁多， 根据其功能可粗略分为限制酶、连 接酶、聚合酶和修饰酶4类。
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4
基因工程的操作，是在分子水平上 的操作，是依赖一些酶 (如限制性 核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶 等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶
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1
体外重组DNA技术所 需的基本条件？
A. 用于核酸操作的工具酶 B .用于基因克隆的载体 C. 用于基因转移的受体菌或细胞
用于核酸操作的工具酶有哪些？
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2
第二章 分子克隆工具酶 Enzymes Used in Molecular
Cloning
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3
在基因工程的实际操作中，工具酶 的使用是一项基本技术。
限制酶是一类能够识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸水解酶。
限制酶存在于细菌中，也存在于一些病 毒中，真核生物中没有限制酶。
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17
一、限制酶的命名与分类
1、命名
1973年H.O. Smith和D. Nathams首次提出命名原则， 1980年Roberts在此基础上进行了系统分类
主要特性
Ⅱ型
Ⅰ型
Ⅲ型
酶分子 内切酶与甲基化酶不在 三亚基双功能酶 二亚基双功能酶
一起
识别位点 4-6bp，多为回文序
二分非对称
5-7bp非对称
列
切割位点 识别序列内或附近特异 无特异性，距识别序 距识别序列下游24-
切割
列1kb外
26bp处
在体外对DNA进行分离纯化、连接 重组或者修饰合成等，都会涉及一 系列酶促反应。
用于基因工程的工具酶种类繁多， 根据其功能可粗略分为限制酶、连 接酶、聚合酶和修饰酶4类。
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4
基因工程的操作，是在分子水平上 的操作，是依赖一些酶 (如限制性 核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶 等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶
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第二讲(1) 分子克隆工具酶—限制和修饰
1 限制酶的发现
20世纪30年代初发现噬菌体在不同菌株之 间的限制现象与不受限制现象， 60年代提出 对上述现象解释的假设: 内切酶能识别并切断外源DNA的某些位点 使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属限制酶 类。
λ噬菌体不同感染株对E.coli不同菌株的感染率
λ噬菌体感染率 E.coli菌株 λ（K） λ（B） λ（C）
由于限制酶要求严格的识别和切割 序列，在一段不大的DNA片段中，酶切 位点是不多的，酶切产物片段的大小和 数目也是固定的。 此特性可用于鉴定酶种类和活性测 定，也用于鉴定DNA片段是否有同源性， 或有无变异。
6 同裂酶（isoschizomer ） （
定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。 定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。 特点： ） 特点：1）识别序列相同 2）切割位点可能不同 ） 同序同切酶：识别序列和切割位点都相同。 同序同切酶：识别序列和切割位点都相同。 Hind II与Hinc II GTY/RAC 与 Hpa II与HpaII C/CGG 与 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同。 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同。 KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC
根据识别序列的规律性，找可能的识别序列。
偶数序列，先找GC、CG、AT、TA，然后找其两侧 的核苷酸。 NGCN NATN NCGN NTAN 奇数序列，先找GNC、CNG、ANT、TNA，然后找 其两侧的核苷酸。 NGNC N NANTN NTNAN NCNGN N代表任意碱基。
一般说，在同一个DNA分子中，识别序列 短的出现的概率大，反之概率小。 原则上有n个碱基的识别序列的出现概率 是1/4n 。 如Sau 3A 识别序列GATC，间隔256(44) 个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。 E. coR I GAATTC ？？
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② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是 相同的，但它们的切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。 ③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含 了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点 为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。 ④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点（识别 切割位点为 G↓TCGAC），该位点也可被 AccⅠ（识 别切割位点为 GT↓MKAC）和 HincⅡ（识别切割位点 为 GTY↓RAC）切割。
1.4 限制性核酸内切酶活性及其影响因素
1.1 引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义
核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致 核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。 1）按作用对象可分为: Deoxyribonuclease (DNAase) & Ribonuclease (RNAase) 2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为： Endonuclease & Exonuclease
PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端：
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平 端或钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ：
Recognition Sequences and Cutting sites of selected Restriction Endonucleases
Enzyme Recognition sequence BamH I G↓GATCC Enzyme Recognition seuqence Pst I CTGCA ↓G
J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\连接酶.swf
OH
P
5` 3`
3` 5`
DNA ligase
5` 3` 3` 5`
DNA ligase 连接缺刻(nick)
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量）和 大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量） 两种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多 肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成 的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不 是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP 转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。
大肠杆菌的DNA连接酶
DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子， 和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的 现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶 Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后,封闭DNA 双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着 重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行 DNA 复制、修复和重组。
Bgl II EcoR I
Hind II Hind III Kpn I Not I
A ↓GATCT G ↓AATTC
GTPy ↓PuAC A ↓AGCTT GGTAC ↓C GC ↓GGCCGC
Sal I Sau3A I
Sfi I Sma I Xba I Xho I
G ↓TCGAC ↓GATC
GGCCNNNN ↓NGGCC CCC ↓GGG T ↓CTAGA C ↓TCGAG
1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl
37℃
1h
限制性核酸内切酶的反应条件
2) 反应系统因素
缓冲液（无菌、无污染） buffer （pH=8.0） ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白) NaCL（0, 500, 1000mM）
双酶切
A有公用Buffer的。（直接用公用Buffer 切）
B两种酶反应温度不同的。（先切其中 一个然后高温失活，再用另外一个酶切） C无公用Buffer的：先用低盐Buffer切几 个小时，再补加盐分到高盐加入另外一 个酶继续切
限制性核酸内切酶的反应条件
3.星活性
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称星星活性,如EcoRⅠ星活性用EcoRⅠ*表
在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合
物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1
单位。
(3)限制性核酸内切酶的反应条件
1)底物 DNA
DNA纯度:
RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 15h
多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针
末端转移酶
S1核酸酶 DNA酶Ⅰ RNA酶A 逆转录酶 磷酸酶
使3`-末端加同聚物尾
降解单链DNA或RNA 在双链DNA上产生随机切口 降解RNA 补平反应，合成cDNA或制探针 切除核酸末端磷酸基
1 限制性内切酶
1.1 引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义 1.2 限制性核酸内切酶的命名 1.3 限制性核酸内切酶的分类
酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ 或Klenow酶
SUMMARY 主要用途 识别DNA特定序列，切割DNA分子 连接两个DNA分子或片段 1 制作DNA探针；2 合成cDNA第二链； 3 填补双链DNA 3`凹端；4 DNA测序。
Taq DNA 聚合酶
多核苷酸激酶
聚合酶链式反应及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）：可使一段DNA的 3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯 键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形 成的切口的酶。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现 的。 J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶.
功能：限制、修饰
特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅 助因子；识别位点和切割位点不一致， 没有固定切割位点（随机性）；
应用：不常用。
功能：限制、修饰
1.3.2 Ⅲ型限制性内切 酶
特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因 子；特异切割，切割位点在识别位点 外，距识别位点3`端24-26bp处。 应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。
示。
影响因素：甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml）， 离子强度低（<25mM）， pH 值过高（>8.0）， 45%聚乙二 醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子， 12%乙醇。
DNA末段的长度对限制酶切割 的影响
需要在识别序列两端存在一定长 度的非识别序列增加切割效率
位点偏爱（Site preference）
限制性内切核酸酶（restriction endonuclease):
指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序
列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA 的核酸内切酶。
限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的 甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统 （Restriction-Modification System)。
1.2限制性核酸内切酶的命名
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一
和第三个字母。
1.3 限制性核酸内切酶的分类
1.3.1 Ⅰ 型限制性内切酶 1.3.2 Ⅱ 型限制性内切酶 1.3.3 Ⅲ 型限制性内切酶
1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶
酶量不超过总体积的 1/10
3L 0.1- 1g 2u
3 L 30 L
思考题
用限制酶BglⅡ消化2ｕg λDNA ，该 DNA浓度为 125ｕg/mL，BglⅡ为 4 units/ｕL.并提供了限制酶BglⅡ的10倍的 缓冲盐体系。请设计一最佳方案来完成 该实验
限制性内切酶的选择
原则：选常见的、活性高的酶， 如果双酶切最好选有公用 Buffer的酶 推荐酶：Promega公司， Takara公司，Tyoyobo公司
分布：主要在微生物中。 作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 举例：大肠杆菌的一种限制酶EcoRI能识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开
(1) 基本特性
识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；最常见的 为6个碱基. 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序 列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如 Sma I (CCC ↓GGG)
(a)分子间连接
(1) · · · · · G 5´ AATTC· G· · · · · · CTTAA 5´ (2) · · · · · G 5´AATTC· G· · · · · · CTTAA 5´
(1) (2) · · · · ·G AATTC· · · · · · G 5´AATTC· G· · · · · · CTTAA G· · · · · · CTTAA
第二章 分子克隆工具酶
分子克隆工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些 酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对
基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之
为“工具酶”。
工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优
化、而产生的生物工程产品。
工具酶