微生物学实验讲义终审稿)

微生物学实验讲义

文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

《生物学实验Ⅰ——微生物》

（2008级基地班）

任课教师：熊芳

教学时数： 15学时

实验周数： 4周

生物学实验教学中心

微生物实验目录（15学时）

微生物实验基础知识介绍

实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）

实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时）

实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时）

实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）

第一次实验：

微生物学实验基础知识

一、实验目的

1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；

2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；

3.掌握实验报告的正确书写。

二、实验内容

1.实验室规则；

2.实验室安全守则；

3.实验室中意外事故处理；

4.常用器皿及用具；

5.显微镜及有关知识；

6.实验预习、实验记录和实验报告。

实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌

配置培养基的基本流程如下：

原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌

培养基的配制原则

一、营养成分

1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。

氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。

能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。

2. 注意各种营养物质的浓度与配比

营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。

各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中

元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。

二、控制培养基的PH值

各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在7-7.5之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。

在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：

内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。

外源调节：按实际需要流加酸或碱液

三、渗透压

注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生长的需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物的生长

四、氧化还原电位

氧化还原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧的毒害。

培养基的种类

据组成成分可分为:

1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。

2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。例如，马铃薯蔗糖培养基。

3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。

从培养基的物理状态可分为

1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。

2.固体培养基：在液体培养基中加入1-2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。

3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。

按照培养基的用途，可将其分为

1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。

2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。

3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。

牛肉膏蛋白胨培养基的制备

一、实验原理

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实

际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：

牛肉膏 3.0g

蛋白胨 10.0g

NaCl 5.0g

水 1000ml

pH 7.4～7.6。

二、实验器材

1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。

2、仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角

匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。

三、操作步骤

1、称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。牛肉

膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。

2、溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加

热，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配置固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足