引物合成设计常见问题与技巧
引物篇引物合成与各种问题总结
引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
引物设计总结
1．寡核苷酸的优化设计在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。
用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。
怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。
1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。
所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。
在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。
在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。
现在，大多采用 Breslauer 等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。
为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。
此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：此主题相关图片如下：ΔG(kcal/mol)例如，双链d(ACGG／CCGT)的ΔG是：ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。
也可以用来计算发夹环结构的ΔG。
不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。
如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal／mo1。
2. 选择引物的一般规则设计和选择引物时有5个要素必需注意。
2.1 引物的3′末端不互补引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。
引物设计注意事项
引物设计首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
非配对结构最好出现在引物中间。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
PCR使用说明引物设计技巧
自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。
使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。
可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。
本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。
引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product len gth），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于7 4℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物设计知识点总结
引物设计知识点总结引物是在分子生物学和遗传学研究中广泛使用的一种技术。
它主要用于DNA或RNA的扩增、测序和检测等实验。
引物设计的质量和准确性对实验结果有着重要的影响。
本文将对引物设计的知识点进行总结和讨论。
一、引物设计的基本原则引物设计需要考虑以下几个基本原则：1. 引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间。
过短的引物可能导致扩增效率低下，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
2. 引物温度：引物的熔解温度（Tm）应在50-65摄氏度之间。
引物的Tm过高可能导致非特异性扩增，而过低则可能导致扩增效率下降。
3. 引物结构：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的3'端应尽量避免含有GC丰富序列，以减少引物自身的二聚体形成。
二、引物序列的选择在引物设计中，需要根据具体的实验目的和DNA序列来选择引物的序列。
以下是常见的引物序列选择策略：1. 引物长度：引物的长度一般为18-30个碱基对。
对于较短的DNA序列或需要快速扩增的实验，可以选择较短的引物；对于复杂的基因或需要高度特异性扩增的实验，可以选择较长的引物。
2. 引物位置：引物应位于目标序列的末端，以提高特异性。
通常，引物应位于目标序列的保守区域，并避免位于变异或多态性较高的区域。
3. 引物序列：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的GC含量应适中，避免过高或过低。
三、引物设计工具为了帮助科研人员进行引物设计，许多在线工具和软件被开发出来。
以下是一些常用的引物设计工具：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，可以根据用户输入的序列和参数，自动设计引物。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST可以在设计引物的同时，对引物与目标序列的特异性进行评估。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer可以评估引物的物理属性，如熔解温度和GC含量，并检查引物是否存在二聚体结构。
引物设计注意问题
引物设计注意问题1．3，端不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。
2．3，端的△G不宜过高，过高会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，其绝对值应该小一些，最好不要超过9。
3．发夹结构（Hairpin Formation）△G绝对值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
4．上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。
5．Tm 值可以控制在50～70度之间。
6．错配（False priming）一般的原则要使错误引发效率在100以下。
7. 等级评定（rating）搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。
8. 内部稳定性（Internal stability）一般引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。
△G绝对值越大结构越稳定。
9. 3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下。
10. GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。
11. GC钳（GC Clamp）一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。
这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。
选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于 3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
12. 二聚体（Dimer）3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。
13. 如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的（16～18 mer）的引物：若产物长5 kb，则用20～23 mer的引物。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是生物学和生物技术领域中非常重要的一个环节。
在分子生物学研究、基因工程、医学诊断、疾病预防等方面，引物设计都起着至关重要的作用。
引物设计的好坏直接影响到PCR扩增、序列特异性分析、RNA干扰、原位杂交、基因克隆等实验的效果和结果。
因此，深入理解引物设计的相关知识点对于提高实验效率和结果的可靠性非常重要。
本文将介绍引物设计的相关知识点，并对其进行归纳总结。
1. 引物设计的基本原则引物是在分子生物学实验中用于对特定DNA或RNA序列进行扩增、检测或特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列。
设计好的引物对于实验的成功至关重要，而引物设计的基本原则包括：(1) 引物长度：引物长度一般在18-25碱基对之间，过短的引物可能导致扩增效率低，而过长的引物可能导致特异性差。
(2) GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的结合性能和特异性。
(3) 引物序列选择：引物的序列选择要尽量避免重复序列、近似重复序列和具有高度变异性的区域。
(4) 引物特异性：引物的特异性是指引物能够与目标序列特异性结合，而不结合其他非特异序列，引物特异性的好坏直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
2. 引物设计的常见问题及解决方法在引物设计过程中，常常会遇到一些常见问题，例如引物特异性不足、引物二聚体形成、引物偏向性扩增等问题。
针对这些问题，有一些解决方法可以参考：(1) 引物特异性不足：可以通过生物信息软件对引物进行预测和评估，合理选择引物序列，避免与非特异序列发生交叉杂交。
(2) 引物二聚体形成：引物二聚体是指引物之间相互结合形成二聚体，导致引物的扩增效率降低。
可以通过调整引物长度和序列，以及优化PCR扩增条件来避免引物二聚体的形成。
(3) 引物偏向性扩增：引物偏向性扩增是指引物对特定序列的扩增效率高于其他序列，可以通过优化PCR扩增条件，如调整引物浓度、反应体系等来解决。
引物设计知识点归纳图解
引物设计知识点归纳图解引物设计是分子生物学和遗传学等研究领域中的重要工具，它在PCR扩增、基因克隆、基因表达分析等方面发挥着至关重要的作用。
在引物设计过程中，需要考虑引物的长度、碱基组成、熔解温度等因素，以确保引物的特异性和稳定性。
本文将围绕引物设计的基本原理、常用工具和实践技巧展开讨论，并通过图解的方式进行归纳总结。
一、引物设计的基本原理引物设计的目标是选择具有高特异性和稳定性的引物，以确保在PCR扩增等实验中的准确和可靠性。
其基本原理包括：1. 特异性：引物应与目标DNA序列的特定区域完全匹配，以避免非特异扩增。
2. 稳定性：引物应具有适当的长度和碱基组成，以确保引物在反应条件下的稳定性。
3. 熔解温度：引物的熔解温度应接近PCR扩增的反应温度，以保证引物的特异性。
二、引物设计的常用工具引物设计可以借助多种在线工具和软件来完成，常用工具包括：1. Primer3：一种广泛应用的引物设计工具，可以根据给定的参数自动设计引物，并进行热力学分析。
2. NCBI Primer-BLAST：结合NCBI数据库和BLAST算法的引物设计工具，用于检验引物的特异性。
3. OligoAnalyzer：根据序列特性进行引物设计和分析的在线工具，可以计算引物的熔解温度和配对特性。
三、引物设计的实践技巧在实践过程中，为了提高引物设计的准确性和效率，可以考虑以下技巧：1. 引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对，较短的引物具有更高的特异性。
2. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，高GC含量可以增强引物的熔解温度和特异性。
3. 引物间配对：引物之间或引物与模板之间的配对应避免，以防止引物间的二聚体形成或引物与模板的非特异结合。
4. 引物位置：引物应位于目标序列的特异区域，避免引物与非目标序列的交叉反应。
5. 引物设计的复杂性：复杂的引物设计场景，如多组引物设计、引物与探针联合设计等，可以借助专业软件进行。
引物合成及各种问题总结
引物合成及各种问题总结（2）admin1.如何测定引物的OD值？用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。
举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.怎样溶解引物？我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。
3.合成的引物应如何保存?没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。
使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。
4.如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。
引物合成常见问题分析
引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。
因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。
所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。
取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。
一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp 的引物使用12% 的凝胶。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行定量了）。
Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。
引物合成常见问题
引物合成常见问题Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
⑴去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH ；⑵耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-0H仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-0H发生耦合反应；⑶封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；（4）氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。
常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。
断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。
常用的纯化方法有：C1& OPC PAGE^ HPLC定量：根据寡核苷酸在260n m处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
Q3.合成的引物5'端是否有磷酸化？合成的引物5'为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。
Q4.需要什么级别的引物？Q5.需要合成多少0D数？根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 0D引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。
加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V （微升）=OD数x 33 x 10000 / 引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。
引物设计注意事项
引物设计注意事项引物设计在基因的相关研究中极其重要，其中自己比较熟悉的一点是基于引物设计的全长cDNA文库的构建。
全长cDNA序列的获取是一个十分困难的过程，因此这类数据在GeneBank库中存储较少。
在过去的试验中，常见的方法是利用PCR对mRNA序列进行多次扩增，尽可能地获得“全长”的cDNA序列，但是这样的方法很难得到完整的UTR区域。
自2000后，发展较迅猛的一个方法是日本一个研究所的“Oligo-capping"方法。
该方法的过人之处在于：为mRNA的设计了两个不同的引物。
在3‘UTR区域，PolyA信号的存在可以很方便地设计对应的引物，在5’UTR区域，该方法用一段寡聚核甘酸代替mRNA的帽子结构，从而很容易地设计出对应的引物。
从理论上讲，这种试验方法可以得到100％的全长cDNA，但是试验中多种因素的制约，使得该方法得到的cDNA中约有50％～80%的全长cDNA。
如果试验生物学家能够解决这个难题，那么生物信息中对基因组的研究将会有很大的飞跃。
汗ing，偶没有做过相关的试验，算是抛砖引玉了，，表砸我。
基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。
为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。
每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术方法，它通过体外去合成DNA的方法，在温度循环条件下，通过DNA聚合酶酶的作用，将目标DNA序列扩增至数百万倍。
PCR引物是PCR反应核心的组分之一，引物设计的合理与否对PCR反应的成功与否有着至关重要的影响。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度：引物的设计需要考虑到目标序列的长度，一般情况下，引物长度推荐在18-25个碱基对之间，过长的引物容易造成PCR效率低下，而过短的引物则可能引起非特异性扩增。
2.引物Tm值：引物的Tm值是指在PCR反应中引物与模板DNA的温度中断，即DNA链断裂的温度。
引物的Tm值应该在PCR反应的退火温度范围内，通常在50-65摄氏度之间，且引物对称Tm相差应小于1-2摄氏度，以保证引物的特异性。
3.引物GC含量：引物GC含量的选择与PCR反应的引物结合和扩增效率有关。
引物的GC含量推荐在40-60%之间，过高的GC含量可能造成引物之间的聚合作用过强，而过低的GC含量可能造成引物与模板DNA结合能够性不足。
4.引物序列重复：引物的序列应避免重复，以免在PCR过程中发生串联扩增。
同时，引物的序列也要尽量避免多次在基因组中出现的位置，以减少非特异性扩增的可能。
5.引物间的相互作用：在设计引物时，还需要考虑引物本身和引物与模板DNA之间的相互作用。
引物之间不应有相互结合的可能性，以免引物之间相互影响降低扩增效果。
同时，引物与模板DNA之间也不应有非特异性的结合，以免引发假阳性结果。
6.引物的特异性：引物的特异性是PCR反应的关键。
在设计引物时，需要通过引物序列的特异性比对和BLAST，确保引物只与目标序列相匹配，而不与其他非目标序列相结合。
7.引物的位点选择：在目标序列上选择引物时，推荐选择在非保守区域的位点，以增加扩增特异性。
此外，在设计引物时，也应避免选择在基因组中出现多个拷贝的区域，以防止在扩增过程中产生非特异性扩增。
引物设计原则和注意事项详解
引物设计原则和注意事项详解1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物3'端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
6、碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3'端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
设计pcr引物的注意事项
设计pcr引物的注意事项
设计PCR引物的注意事项包括以下几点：
1.引物长度：一般为15～30个碱基，引物太短会降低扩增特异性。
引物过长退火温度会提高，不利于反应的发生。
2.引物序列：设计引物时碱基要随机分布，避免碱基或核苷酸的重
复导致错误引发；引物间和引物自身序列也要尽量避免互补，防止形成引物二聚体或发夹结构。
3.碱基分布：GC含量一般40-60%，含量过高或过低都不利于进行
反应。
其含量过低会使引物不稳定；过高会引发非特异性扩增。
4.Tm值：引物的Tm值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T），尽可能
保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。
5.引物设计好后进行BLAST检查，检测是否与基因组中重复序列或
其它基因位点有交叉同源。
6.引物的特异性：引物的3'端如果含有一个G或C残基能增加引物
的特异性。
请注意，以上仅为PCR引物设计的基本原则，具体操作时可能还需要考虑其他因素，建议咨询专业人士获取帮助。
引物合成常规问题
Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；(3) 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。
常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。
断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。
常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。
定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
Q3.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 60base HEPD>60 base PAGE诊断PCR扩增< 40base HEPD, PAGEDNA测序20base左右HEPD亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPDPAGE反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ4.引物的质量是不是跟序列有关？四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。
所以合成难度是不一样的。
难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。
尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计知识与技巧分析点击次数：309 发布时间：2010-7-19PCR引物设计知识与技巧分析自从1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCP) 以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。
然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。
现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。
1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。
但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。
因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。
所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。
下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。
①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量。
②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。
特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。
③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。
④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol。
引物合成常见问题分析.
引物合成常见问题分析1．需要合成多少OD的oligo？一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及2000—2500 次的测序反应。
因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。
所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。
如何测定引物的OD值：DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。
取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
2.如何检测Oligo DNA的纯度？实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。
一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp的引物使用12% 的凝胶。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
3.使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带？由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose 电泳时，容易出现多条泳带（更不能用 Agarose 电泳来进行定量了）。
Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。
引物设计注意事项
引物设计注意事项引物设计在基因的相关研究中极其重要，其中自己比较熟悉的一点是基于引物设计的全长cDNA文库的构建。
全长cDNA序列的获取是一个十分困难的过程，因此这类数据在GeneBank库中存储较少。
在过去的试验中，常见的方法是利用PCR对mRNA序列进行多次扩增，尽可能地获得“全长”的cDNA序列，但是这样的方法很难得到完整的UTR区域。
自2000后，发展较迅猛的一个方法是日本一个研究所的“Oligo-capping"方法。
该方法的过人之处在于：为mRNA的设计了两个不同的引物。
在3‘UTR区域，PolyA信号的存在可以很方便地设计对应的引物，在5’UTR区域，该方法用一段寡聚核甘酸代替mRNA的帽子结构，从而很容易地设计出对应的引物。
从理论上讲，这种试验方法可以得到100％的全长cDNA，但是试验中多种因素的制约，使得该方法得到的cDNA中约有50％～80%的全长cDNA。
如果试验生物学家能够解决这个难题，那么生物信息中对基因组的研究将会有很大的飞跃。
汗ing，偶没有做过相关的试验，算是抛砖引玉了，，表砸我。
基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。
为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。
每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
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1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种，主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3‘端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3‘端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%.适用于40mer 以下引物的纯化。
◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA （大于50mer）的纯化特别有效。
◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%.主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3. 引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm,石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4. 投诉定量不准是怎么回事儿？答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（1）生产人员定量错误。
这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。
公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。
合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。
一般情况下，引物都有留样。
接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。
（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。
这种情况很少见。
（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。
使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。
（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。
这种情况比较常见。
（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2.5. 需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
答：引物越长，出现问题的概率就越大。
我们合成过120base的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7. 需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR 反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR,但是却要5-10 OD.做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长，最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8. 如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃，2mins）。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
9. 如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul. 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。
如果不一致，请和我们联系。
我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积（微升）按下列方式计算：V （微升）= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / （除）引物的分子量。
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml。
10. 如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm,引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃（G + C）+ 2℃（A + T）对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 （%GC）– 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.11. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的？答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x 碱基的平均分子量。
或按下列公式计算MW= （NA * WA）+ （NC * WC）+ （NG * WG）+ （NT * WT）+（Nmod * Wmod）+（Nx * Wx）+（Ni* Wi）+16* Ns– 62.NA，NG，NC，NT，Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA，WC，WG，W，Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21.Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量13. 如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。
溶解后的引物-20度可以长期保存。
如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
修饰荧光引物需要避光保存。
14. 合成的引物5‘端是否有磷酸化？答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5‘端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3‘端进行磷酸化，需要另外收费。
15. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。
SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
16. 测序发现引物有突变是怎么回事？答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率不大，但是肯定也会发生。