第十一章植物体细胞杂交

第十一章植物体细胞杂交

第一节植物体细胞杂交的概念与发展历程

一、植物体细胞杂交的类型、概念

植物体细胞杂交按照所用亲本原生质体的性质可以分为三类：第一类为常用的体细胞杂交，即用双亲的体细胞原生质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选、鉴定等步骤得到细胞杂种；第二类是配子间细胞杂交，即用双亲的性细胞原生质体为融合亲本，其他步骤同第一类；第三类是配子－体细胞杂交，即一个融合亲本为性细胞原生质体，另一个为体细胞原生质体，其他步骤同第一类。目前仍以体细胞杂交为多，其他两类也开始有所报道（夏镇澳，1997）。下面仅对植物体细胞杂交加以介绍。

植物体细胞杂交即原生质体融合（见图11.9），是在植物原生质体培养技术基础上，借用动物细胞融合方法发展和完善的新型生物技术，包括原生质体制备、细胞融合诱导、杂种细胞筛选与培养以及杂种植株再生与鉴定等技术环节。早期，在许多植物属内、种间和种内的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株，如烟草属、曼陀罗属等。目前，由于植物原生质体培养技术的迅速发展，尤其是禾本科和豆科等重要粮食作物原生质体操作关键技术的突破，使这两类作物的体细胞杂交也能产生种间或属间杂种（钱迎倩等，1990）。

图11.9 原生质体电融合

（引自Koop and Schweiger，1985）

二、植物体细胞杂交发展历程

1960年，Kocking首次获得通过酶法制备的高等植物原生质体；

1970年，Power首次通过硝酸钠作为诱导剂进行较大规模原生质体诱导融合；

1971年，Takebe离体烟草原生质体培养首次获得再生完整植株；

1972年，Carlson首次获得第一个植物细胞杂种――粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种。1974年，Kao采用聚乙二醇诱导融合法诱导植物细胞融合，建立了相应的融合技术；1978年，Melchers首次获得属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）；

1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；

1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。

第二节植物原生质体融合的方法

目前，诱导体细胞融合的方法主要有电融合法（Zimmermann，1982）和聚乙二醇（PEG）高钙高pH值法（Kao，1977）。

一、电融合法

电融合法与PEG融合法相比具有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。

电融合的基本过程：1、细胞膜的接触；2、膜的击穿。电融合的主要参数包括交流电压、

交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。

二、聚乙二醇（PEG ）高钙高pH 值法

优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。

第三节 杂种细胞的发育动态及体细胞杂种应注意的问题

一、杂种细胞的发育动态

诱导植物原生质体融合后会产生不同的融合结果（见图11.10），包括杂种和胞质杂种。胞质杂种是指所得到的细胞杂种完全没有供体的核基因，而仅仅是转入供体的叶绿体和线粒体基因。

(cybrid)胞质杂种

(cybrid)杂种(hybrid)杂种(hybrid)

图11.10 两种遗传上不同植物原生质体融合后可能产生的结果

核质重组、细胞器重组、部分核物质或细胞器丢失、核分裂的非同步性

二、体细胞杂种选择应注意的问题

体细胞融合可以克服常规植物育种中远缘杂交不孕性，实现遗传物质的交流，用以将控制优良性状的基因导入被改良的受体内，获得细胞杂种，创造新的育种材料或优良品系，丰富植物基因库。但为了将体细胞杂交技术更好地应用于生物资源开发和作物品种改良，在进行体细胞杂交研究时，应考虑以下主要问题：

① 杂交组合的选择。近缘种内或种间的体细胞杂交具有较强的目的性，因此，在进行杂交组合选择时，应选择再生能力强、具有优良农艺性状（高产、优质、抗病、抗逆等）的野生种或近缘种，通过细胞融合将优良特性导入相应的栽培种或近缘种，创造新的育种材料或新品种。

② 原生质体的制备。体细胞融合一般要求新鲜、制备时间较短的原生质体，因分离时间过长，原生质体开始长壁，影响融合效果。

③ 融合方法。经改良的电融合法要优于PEG 法，而且操作简便，对细胞无毒害作用（Bates and Hazenkampt ，1985），诱导频率较高。但由于电融合需要昂贵的电融合仪，这种方法现在应用并不普遍。PEG 法操作比较复杂，融合效果受原生质体的生理状态、纯度、密度，PEG 的质量和浓度，处理时间，钙离子浓度，洗液成分以及诱导融合程序等因素影响较大，在融合时应加以考虑。

④ 选择杂种的方法。应用遗传或生理互补的选择方法能够在愈伤组织水平或再生植株中有效地选择杂种。但应考虑到杂种细胞生长发育过程中染色体的丢失，即通过遗传互补选

择法进行杂种细胞选择时，淘汰了丧失标记基因的体细胞杂种。因此，进行杂种选择时要小心谨慎。

⑤由杂种细胞诱导获得再生植株是否为杂种的鉴定方法。根据形态学、细胞学、分子生物学和生物化学，用抗性鉴定、育性鉴定、叶绿体DNA、线粒体DNA、核DNA、RuBp 羧化酶分析和同工酶谱分析等方法，对获得的再生植株进一步分析和鉴定，以证实再生植株杂种的真实性。