醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3的表达影响

醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3的表达影响

贾庆华杨霄鹏杨志华哈小琴﹡唐瑜

（中国人民解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃省干细胞与基因药物重点实验

室，甘肃兰州730050，﹡通讯作者）

摘要目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞（HRMC）凋亡作用及Caspase-3活性的影响。方法醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒HRMC 6、12、24、48h后，四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞增殖。经醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒24h 后Hochest33342染色法检测观察细胞形态学变化；细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting检测Caspase-3的转录与表达。结果与空白对照组相比，不同浓度的铅均不同程度的抑制了HRMC的增殖(P<0.01)。Hochest33342-PI染色显示出醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting结果显示醋酸铅组的Caspase-3转录与表达升高。结论醋酸铅可促进人肾小球系膜细胞凋亡, Caspase-3参与了凋亡过程。

关键词: 醋酸铅；人肾小球系膜细胞；Caspase-3；凋亡

The Caspase-3 expression in the toxic effect of lead acetate on the human renal

mesangial cells(HRMC)

JIA Qing-hua Yang Xiao-peng Yang Zhi-hua HA Xiao-qin Tang Yu (Experimental Center of Medicine, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Key Labaratory of Stem Cell and Gene Drug in Gansu Province,

Lanzhou 730050, Gansu Province, China)

Abstract Objective To investigate the effects of lead acetate on apoptosis and activity of caspase-3 in human renal mesangial cells(HRMC). Methods After treated with 5、10、20μmol/L lead acetate 6、12、24、48h, methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) was performed to measure HRMC proliferation. Hochest33258-PI staining was applied to observe the morphological changes, and the transcription and expression level of Caspase-3 was detected with immunohistochemical method, RT-PCR and Western blotting after lead(5、10、20μmol/L) treating HRMC 24h. Results Lead acetate significantly inhibited the cell viability of HRMC(P<0.01). Characteristical changes of apoptosis in HRMC were observed in the treated group. RT-PCR、western blotting and immunohistochemical analysis indicated the transcription and expression of Caspase-3 was increased by the treatment. Conclusion Lead acetate could induce apoptosis in HRMC with a possible mechanism which may be related to the activation of caspase-3.

Key words: lead acetate; human renal mesangial cells(HRMC); Caspase-3; apoptosis

铅是环境中广泛存在的一种强重金属毒物，对机体的各个系统都有损害，特别是对肾脏。肾脏承担了近2/3排泄途径再由尿道排出[1]，当排泄率降低而吸收率升高，更易造成铅在体内的蓄积，最终导致铅中毒。大量研究动物实验已经证明铅中毒引起肾脏功能的损伤[2,3]，但其损伤机制尚不清楚。目前有关醋酸铅肾

甘肃省支撑计划项目(090NKCA106)

脏细胞的毒理研究的报道还不多见。本文利用体外培养的人肾小球系膜细胞（HRMC），观察醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3的表达影响，为研究铅对肾脏损伤机制提供一定的思路。

1 材料与方法

1.1材料醋酸铅（天津凯通），人肾小球系膜细胞（本实验室保存），胎牛血清（杭州四季青）；DMEM，胰蛋白酶，Hoechst-PI染色试剂盒（美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT）；Rabbit Anti-Caspase-3(P11)(武汉博士德)，SP 免疫组化试剂盒（北京中杉），RNA提取试剂盒、逆转录酶、Taq酶、Olig(dT)15(大连宝生物)，Western blotting发光剂（武汉博士德）；电泳仪（北京六一），倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）。

1.2方法

1.2.1 HRMC培养及MTT检测单细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，将培养板置于细胞培养箱中，待细胞贴壁后换无血清培养液培养12h使细胞同步化，吸去培养液，换含不同浓度醋酸铅（5、10、20μmol/L）的完全培养液，全部实验均以加不含醋酸铅的完全培养液组为对照组，每个浓度设6个复孔，于染铅后6、12、24、48h，每孔分别加入20μL MTT溶液（5mg/mL），37℃继续培养4h后，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入200μL DMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔570nm光吸收值，记录结果。

1.2.2细胞荧光染色（Hoechst33342-PI染色法）细胞培养于25cm2的培养瓶中，待长成致密单层后用0.25%胰蛋白酶消化，接种于已铺好盖玻片的六孔板中，待细胞处于对数生长期时，加入5、10、20μmol/L浓度的醋酸铅，并留有对照组。待24h培养后，弃培养液，加入0.5ml固定液，10min后用PBS洗2遍，加入0.5mlHoechst33342和PI染色液，37℃避光染色15min，荧光显微镜下观察、照相。

1.2.3 Caspase-3免疫细胞化学的检测将细胞吹打成单细胞悬液(5×104 /ml)，接种于铺有盖玻片的6孔培养板（2ml/孔），对照组加不含醋酸铅的完全培养液，实验组换含5、10、20μmol/L醋酸铅的培养液培养24h后采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法，按照试剂盒说明书进行。二氨基联苯胺（DAB）显色，避光10min，显微镜下观察并照相。

1.2.4 RT-PCR方法检测Caspase-3 mRNA的表达提取细胞总RNA，收集细胞按每瓶细胞量加入1mlTrizol，匀浆2-5min后转移至1.5mldorf管中，加入200μl 氯仿充分混匀，静止5min后4℃12 000 r/min离心10min（离心半径8cm ），转移上清至另一干净dorf管，加入等体积异丙醇充分混匀，室温静置30min后4℃12000 r/min离心10min，弃去异丙醇加入500μl 75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃12000rpm离心5min，弃上清，待沉淀晾干后加入30μl DEPC水溶解RNA沉淀。在20μl反应体系中加入10μl RNA，2.5mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）2μl，Olig(dT)15 1μl，反转录酶（200 ×106U/L）0.5μl，5×RT-Buffer4μl，无Rnase 水2.5μl，42℃温浴90min，65℃加热5min结束反应。反转录后的cDNA于-20℃保存备用。按照已报道的Caspase-3的cDNA序列设计特异性引物（引物均由大连宝生物公司合成）：上游为5-CCAGAAGTACACGCAGTCC-3，下游为5-CGATAGCCCAAGGAAGTC-3，产物大小为228bp；内参β-actin引物序列：上游为5-TCATGAAGTGTGACGTTGCATC-3，下游为5-CCTAGAAGCATTTGCGGTGC-3，产物大小为284bp。PCR方法检测Caspase-3mRNA的表达量，反应体系如下：cDNA 1μl，Caspase-3上下游引物各