血红蛋白的提取与分离

(三）蛋白质的分离的方法
•凝胶色谱法：又称分配色谱法
•电泳法
（三） 凝胶色谱法 1、别名：分配色谱法
2、分离蛋白质的依据：
蛋白质相对分子质量的大小
3、凝胶 ①特点：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿 的通道 ②实例：葡聚糖、琼脂糖
பைடு நூலகம் 原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较大 无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快
2、试剂的配制 ①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺: 用去离子 水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯 酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液 ②十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成 10%的贮存液，于室温保存
讨论：
4、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包 括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首 先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等 操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再 经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗 分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较 大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙 烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定
( 二）蛋白质的分离
分离蛋白质的依据：
根据蛋白质各种特性的差异：
•分子的形状、大小 •电荷性质和多少 •溶解度 •吸附性质 •对其他分子亲和力
补充：蛋白质的性质
• 两性电解质：可表现酸性也可表现碱性， 因为既含酸性基团——羧基，又含碱性基 团——氨基 • 可溶于水，呈胶体状 • 盐析：向蛋白质溶液加高浓度无机盐，蛋 白质以沉淀析出，再加水稀释，沉淀消失， 蛋白质溶解。此过程可逆，不影响蛋白质 性质 • 变性：强酸，强碱，高温，重金属作用下 蛋白质的空间结构被破坏，蛋白质变性。
③原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它 所带静电荷的多少以及分子的大小等因素 ④ SDS作用 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入SDS
⑤ SDS作用机理 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组 成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单 条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子 量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS 复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白 质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间 的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的 大小 用途: 测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度
装 配 好 的 凝 胶 柱
（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面 加样前打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，关闭出口 ②滴加透析样品 吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品 时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注 意不要破坏凝胶面
③样品渗入凝胶床
加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品 完全进入凝胶层后，关闭下端出口
•离心分层； •滤纸过滤去除脂溶性沉淀层； •分液漏斗分出红色透明液体。 A、过程 a、将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min
高速长时离心
分离血红蛋白溶液
b、试管中溶液层次
有机溶剂 脂类物质
无色透明的甲苯层
第 1层
白色薄层固体脂溶性物质沉淀层 第2层
血红蛋白溶液
（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操 作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
（二）操作过程 1、样品处理
思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
（四）缓冲溶液 1、概念 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 2、作用 能够抵制外界的酸或碱对溶液的PH值的影响， 维持PH基本不变
3、缓冲溶液的配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调 节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围 内使用的缓冲液
4、常见的缓冲溶液成分 H2CO3 NaH2PO4 NaHCO3 Na2HPO4
“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分 离范围 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸 水7.5克
②凝胶的预处理 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水 浴加热，逐渐升温至沸腾，通常只需1-2h,可节约 时间，也可除去凝胶中的微生物和气泡 ③凝胶色谱柱的装填方法
思考
人们用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物成 熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有 DNA，便于进行DNA的提取，哺 乳动物的成熟红细胞无细胞核， 结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白
看书：64、65页，思考以下问题：
• 1、蛋白质分离的依据是什么？方 法是什么？ • 2凝胶色谱法分离蛋白的依据是什 么？原理又是什么？其过程怎样？ • 3缓冲液的作用是什么？如何配制？ 又有何实践意义？
A、固定
将色谱柱垂直固定在支架上 B、装填
将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内， 装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀
注意：
1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间 的空隙 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降 低分离效果
装填完连接
洗脱瓶
约50厘米操作压
④洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸 缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时 注意： 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡 混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分 子物质的分离效果 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的 差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分 子的分离
3、类型 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 4实例： ①应用 SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 ②聚丙稀酰胺凝胶 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N′-亚甲基双丙烯 酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三 维网状结构的凝胶
4、基本组成单位 氨基酸 5、氨基酸通式 H R
C NH2
COOH
6、氨基酸连接方式 脱水缩合
7、肽键 CO NH
8、蛋白质形成过程
氨基酸 脱水缩合
肽链 （一条或者多条）
盘曲折叠
蛋白质
9、蛋白质结构的多样性原因：
氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺 序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 10、颜色反应：
讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量的 标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的 标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和 分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋 白质的分子量。
第二课时
二、实验操作 （一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
④洗脱
收集得到的纯化后的蛋白
小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度， 连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱
⑤收集：
待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液， 每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带 均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
收集得到的纯 化后的蛋白
利用透析袋透析
思考
• 为何使用PH=7的磷酸缓冲液中透析？为什 么缓冲溶液的量远多于血红蛋白溶液量？
目的：为了维持血红蛋白的正常特性。 因为：有利于杂质分子充分地向外扩散。
2、纯化——凝胶色谱法
（1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端 需用砂纸磨平 ②底塞的制作：
打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼 龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的 一端
思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是 什么？它的目的是什么？
磷酸缓冲液，利用缓冲液模拟细胞内的PH 环境，保证血红蛋白的正常结构和功能， 便于观察(红色)和科学研究其(活性)
（五）电泳：
1、概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2、原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都 具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基 团会带上正电或负电 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动
开 始 进 行 层 析
⑥注意：正确的加样操作 1、不要触及破坏凝胶面 2、贴壁加样 3、使吸管管口沿管壁环绕移动
讨论： 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲 液处理的目的是什么？ 答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持 结构和功能
（三）纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、目的
鉴定血红蛋白纯度
垂直向下移动 较快 较短 先从凝胶柱洗脱 出来
小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部
垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒内部 较慢 较长 后从凝胶柱洗脱 出来
运动方式 运动速度 运动路径 洗脱次序
思考
使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分 子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程, 可表示为图中 （ B ）
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法的原理—分子筛效应
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；先洗脱出来 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢，后洗脱出来
蛋白质分离和提取的原理
分子量 直径大小
大
小
大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面
红色透明液体
第 3层
红细胞破碎物沉淀
暗红色沉淀物 第4层
③分离 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗 中静置片刻后，分出下层的红色透明液体
④粗分离—透析
①过程 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋 放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l 的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时 ②透析目的 除去样品中分子量较小的杂质
蛋白质的功能
运输
催化
调节
构成细胞和生物体结构 的重要物质
免疫
血红蛋白的提取和分离
一、基础知识
(一）回忆蛋白质 1、含量 占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的 有机物 2、组成元素 C、H、O、N，有的含有P、S还有的含Fe、 Mn、Zn、I等 3、相对分子质量：10000—1000000之间甚至 更高高分子化合物
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA 的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富便于提取血红蛋白。 本课题可以选用猪、牛、羊、等哺乳动物的血液
(1)血液组成
①血液组成
血 血 液
血浆蛋白 浆 无机盐 固体物质 磷脂 葡萄糖等 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 2条a－肽链 血红蛋白 2条β一肽链 （90％） 4个亚铁红素基团
水分
血细胞
(2)样品处理及粗分离过程： ①红细胞的洗涤
A、洗涤红细胞目的 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，不可洗涤次数过少
B、洗涤操作
a、采集血样，向血液中加柠檬酸钠 b、低速短时间离心（速度越高和时间越长会 使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的 效果）
c、吸取血浆：用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆 d、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9 ％的氯化钠溶液洗涤
蛋白质+双缩脲试剂
紫色
思考
高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质的何种作 用，作用结果是什么被破坏？（ A） A、变性、变性、空间结构 B、分解、变性、化学结构 C、变性、变性、平面结构 D、分解、分解、空间结构
血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁
血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。
e、缓慢搅拌10分钟
f、低速离心（低速短时间） i、重复4、5、6步骤三次，直至上清液中已 没有黄色，表明洗涤干净
②血红蛋白的释放
加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲 苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加 速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白
磁力搅拌器
搅拌器正在工作
③分离血红蛋白溶液
注意事项：
底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的 凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液 体残留，蛋白质分离不彻底 ③顶塞的制作 打孔 ④组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 安装玻璃管
⑤安装其他附属结构
（2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择 A、材料 交联葡聚糖凝胶（G-75）
B、代表意义：