苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

09级园林工程系生物技术及应用班级

(制作人—王珏指导教师—韩磊)

内容提要

本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。

关键词

苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1玻璃器皿

烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等

1.1.2实验仪器

超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等

1.1.3其他用具

研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等

1.1.4实验材料

土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉

1.2方法与步骤

1.2.1选择性培养及扩大培养

1.2.1.1灭菌前准备

1)PBA培养基的制备

PBA培养基配方（1L）

配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠）

2）灭菌器材的准备

将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.1.2灭菌

1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水；

2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟；

3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖

好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→

待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的

过程；

4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压

强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到

0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再

次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接

通电源；此后为升压保压的过程；

5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程；

6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出；

1.2.1.3样品的预处理

三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置

1.2.1.4超净工作台的准备

接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。

1.2.1.5无菌操作

1）培养基的完善及分装（对照试验）

分装到无菌的小三角瓶内。

注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。）

2）接种

各组将适量的样液过滤液过滤到搖瓶培养基内，然后在搖瓶外壁上标明样品名称、接种时间及小组序号；最后将所有的搖瓶包扎好进行培养。

1.2.1.6培养

在所有搖瓶的外壁上标明样品名称、接种时间及小组

号，随后将搖瓶置于200r、min的摇床上进行培养。培养

24h后下摇床并置于冰箱内保存，等待菌种分离

1.2.2菌种分离及纯化

1.2.2.1灭菌前准备

1)BP培养基的制备

BP培养基配方（1L）

配方牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂PH

用量5g 10g 5g 20g 7.0-7.2

配置900mL的BP固体培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有600mL不含氯化钠）

2）灭菌器材的准备

将需要灭菌的培养皿、涂布棒、移液管、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.2.2灭菌

准备就绪后利用手提式灭菌锅进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.2.3超净工作台的准备

接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。

1.2.2.4无菌操作

1）培养基的完善及分装（对照试验）

倾注到无菌的培养皿内。

注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。）

2）涂布接种

平板培养基的凝固→用无菌的移液管从搖瓶内吸取

1-2mL的菌液→涂布平板

1.2.2.5培养

在所有平板的外壁上标明样品名称、接种时间及小

组号，随后将搖瓶置于30℃的光照培养基内进行培养，

三天后观察并记录结果。

1.2.2.6菌种的分离及纯化

观察菌种在不同平板培养基中的长势并对其进行分

析，然后挑选出长势较好的平板菌种进行纯化，对个别菌种进行分离。

1）BP固体培养基的制备

制备400mL的BP固体培养基→分装出十三只试管（每管大约10mL培养基，用于菌种分离）→将所剩的培养基装于三角瓶内→分别对试管、三角瓶封口并包扎→灭菌（121℃,20min）

2）灭菌器才的准备

将实验所需的搁置架、纱布、培养皿接种环进行分别包扎后用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

3）无菌操作（即：菌种的分离及纯化）

超净工作台准备就绪后事先将灭菌的培养基倒平板，然后在酒精灯火焰附近将长势较好的平板菌种进行纯化；纯化后再将挑选出的个别单菌落进行分离。

4）培养

将纯化的平板菌种和分离出的试管菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养。

1.2.3菌种的鉴定

由于第一次进行分离时菌种长势不好所以利用的是补救实验中再次分离出的四种不同的菌种以及从菌粉中分离出的六个菌种进行了鉴定。