苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定09级园林工程系生物技术及应用班级(制作人—王珏指导教师—韩磊)内容提要本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。

关键词苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法1.1实验材料1.1.1玻璃器皿烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等1.1.2实验仪器超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等1.1.3其他用具研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等1.1.4实验材料土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉1.2方法与步骤1.2.1选择性培养及扩大培养1.2.1.1灭菌前准备1)PBA培养基的制备PBA培养基配方（1L）配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠）2）灭菌器材的准备将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.1.2灭菌1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水；2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟；3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的过程；4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到0mpa时打开放气阀放气。

放完气后关掉放气阀接通电源，再次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接通电源；此后为升压保压的过程；5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。

重复上一步操作，使此过程保持20分钟。

此后为降压出锅过程；6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出；1.2.1.3样品的预处理三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置1.2.1.4超净工作台的准备接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。

1.2.1.5无菌操作1）培养基的完善及分装（对照试验）分装到无菌的小三角瓶内。

注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。

）2）接种各组将适量的样液过滤液过滤到搖瓶培养基内，然后在搖瓶外壁上标明样品名称、接种时间及小组序号；最后将所有的搖瓶包扎好进行培养。

1.2.1.6培养在所有搖瓶的外壁上标明样品名称、接种时间及小组号，随后将搖瓶置于200r、min的摇床上进行培养。

培养24h后下摇床并置于冰箱内保存，等待菌种分离1.2.2菌种分离及纯化1.2.2.1灭菌前准备1)BP培养基的制备BP培养基配方（1L）配方牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂PH用量5g 10g 5g 20g 7.0-7.2配置900mL的BP固体培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有600mL不含氯化钠）2）灭菌器材的准备将需要灭菌的培养皿、涂布棒、移液管、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.2.2灭菌准备就绪后利用手提式灭菌锅进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.2.3超净工作台的准备接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。

1.2.2.4无菌操作1）培养基的完善及分装（对照试验）倾注到无菌的培养皿内。

注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。

）2）涂布接种平板培养基的凝固→用无菌的移液管从搖瓶内吸取1-2mL的菌液→涂布平板1.2.2.5培养在所有平板的外壁上标明样品名称、接种时间及小组号，随后将搖瓶置于30℃的光照培养基内进行培养，三天后观察并记录结果。

1.2.2.6菌种的分离及纯化观察菌种在不同平板培养基中的长势并对其进行分析，然后挑选出长势较好的平板菌种进行纯化，对个别菌种进行分离。

1）BP固体培养基的制备制备400mL的BP固体培养基→分装出十三只试管（每管大约10mL培养基，用于菌种分离）→将所剩的培养基装于三角瓶内→分别对试管、三角瓶封口并包扎→灭菌（121℃,20min）2）灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿接种环进行分别包扎后用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

3）无菌操作（即：菌种的分离及纯化）超净工作台准备就绪后事先将灭菌的培养基倒平板，然后在酒精灯火焰附近将长势较好的平板菌种进行纯化；纯化后再将挑选出的个别单菌落进行分离。

4）培养将纯化的平板菌种和分离出的试管菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养。

1.2.3菌种的鉴定由于第一次进行分离时菌种长势不好所以利用的是补救实验中再次分离出的四种不同的菌种以及从菌粉中分离出的六个菌种进行了鉴定。

1.2.3.1菌种的分离1）BP固体培养基的制备制备500mL的BP固体培养基后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。

2）灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。

3）灭菌准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

4）菌种的分离超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近将挑选出的四种平板菌种分离到试管斜面上。

5）培养标记好分离菌种的形态及代号后将菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果。

另外从购买的苏云金芽孢杆菌纯菌粉中分离出菌种1）BP固体培养基的制备制备500mL的BP固体培养基后事先分装出200mL试管培养基；随后将剩余的培养基置于大三角瓶内，随后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管和三角瓶进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。

2）无菌水的制备分别向五个小三角瓶内加放10mL、9mL、9 mL 、9 mL 、9 mL 的蒸馏水；随后用棉塞和牛皮纸进行包扎，以备灭菌（121℃,20min）。

3）其他灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环、涂布棒进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。

4）灭菌准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

5）菌种的分离超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近进行无菌操作。

操作流程如下：倒平板→平板培养基的凝固→菌悬液的制备（称取0.0001g菌粉溶于10mL的无菌水中）→摇匀→菌悬液的梯度稀释（利用其他四瓶无菌水完成负一至负四梯度的稀释，）→摇匀稀释液→徒步接种（每梯度的稀释液重复两个平板）→培养→适时转接试管斜面→培养注（每次在用移液管和涂布棒的前后务在酒精灯火焰处进行灭菌，且在其温度降下后再使用为的是其避免烫死菌体）1.2.3.2菌种的鉴定一、明胶液化实验1)实验原理：有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶（即：类蛋白水解酶）。

明胶酶能将明胶水解为多肽，进一步水解为氨基酸，使得明胶失去凝胶性质而液化。

又明胶在20℃的温度下开始液化且培养温度却高于20℃，所以让培养后的平板和试管菌种经过低温处理或者利用倾注酸性升汞法来验证该菌是否产生明胶酶即：是否为阳性，从而排除温度对明胶液化的因素。

2）操作步骤：明胶培养基配方（1L）按照培养基配方配置1400固体培养基↓分装试管（800mL）（每支斜面培养基高度约为试管的1/2）↓灭菌器才的封口及包扎↓灭菌（121℃,20min）↓超净工作台的准备及表面消毒↓平板培养基的分装及冷凝↓穿刺接种及点植（对4-10号菌种进行穿刺及点植）↓标记↓培养（将平板、试管菌种置于36℃的光照培养箱昂内进行培养，三天后观察结果）3）鉴定过程挑选出每种菌体经点植后长势较好的平板菌种→40ml酸性升汞的配置→滴加升汞→静置→与没有滴加升汞的菌种进行对比，观察现象。

滴加升汞的过程对照试验：成分明胶琼脂蒸馏水用量4g 5g 1000mL按照上述配方配置500mL的培养基↓倒平板↓培养基的凝固↓滴加升汞↓静置↓与空白最对照，观察现象二、精氨酸脱羧酶试验1）实验原理：有的菌体能产生脱羧酶，令氨基酸发生脱羧反应生成胺和二氧化碳，从而使得培养基的PH发生变化。

利用该原理使分离出的菌落在加放精氨酸的培养基上进行生长，让溴甲酚紫作指示剂，来验证菌体的特性。

补充：溴甲酚紫显色原理其变色范围为pH（5.2-6.8）；当pH为5.2时显黄色，当pH为6.8时显紫红色。

2）方法与步骤（1）培养基的制备精氨酸培养基配方制备500mL的精氨酸液体培养基（不含DL-精氨酸）后分装至31个试管内，随后往21个试管内滴加适量的石蜡封口；最后用牛皮纸和麻线对试管进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。

注（因DL-精氨酸不能高温加热，所以在培养基灭菌之后再向各个管中滴加DL-精氨酸；）（2）灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种针、镊子、棉花以及盛有20mL蒸馏水的三角瓶进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。

（3）灭菌准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

（4）培养基的完善称取0.5g精氨酸→溶于无菌水中→摇匀→置于无菌的培养皿内→无菌针头内无菌棉的加放→药品的吸取→加放精氨酸（每支管加放0.4mL）→摇匀培养基→接种（每个菌种取三次样分别置于两个滴加精氨酸的培养内和一个不加精氨酸的培养基内）→摇匀→标记→培养→观察管内变化注（在使用接种针的前后都要对其进行灼烧即：灭菌，且灭菌之后必须将其降温再使用，避免烫死菌落）对照试验接种之前事先留出一只不加精氨酸和一只加放精氨酸的培养基，随后不加放菌落随同接种的菌管进行培养。

（5）培养标记好分离菌种的代码后将菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果并得出结论。

保种为了以后生化实验对菌种的供应，所以对各个菌种进行保存；转接前剔去不知菌种来源以及不能再使用的试管菌种。