SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
ß
把膜置于第二抗体中，温和振荡2小时
ß
在TBST中洗膜1小时，中间更换4次
ß
显影，定影这一步骤为最重要的步骤之一，非常容易出现问题，必须小心仔细，我们在实验中采用的是上海康成公司生产的第二代化学超敏发光试剂盒，说明书另附PDF。在实验中发现有时发光很快减弱；肉眼可以看到发光，但是底片显不出来等问题。联系了康成公司的技术员，改动如下：膜与发光显色剂接触时间改为2分钟（不是说明书中的5min），底片压片时间2分钟。显影时有一些基本的原则，如严格的避光，压片前注意排除气泡，压片过程中底片不能接触液体等，按照一定的规则放置膜。将底片压片曝光结束后，将其中一角折起以助定位。定影后将膜贴于显出的条带，条带旁表明marker条带。底片注明实验日期、名称。
（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cruz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
通过SDS（十二烷基硫酸钠，Sodium Dodecyl Sulfate）将蛋白质变性并赋予负电荷，在凝胶电泳中，根据蛋白质的分子量大小，使蛋白质在电场中向阳极方向运动，从而实现蛋白质的分离。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白质的分子量测定、复杂蛋白质混合物的分离、蛋白质组学研究等领域。
它具有简单易行、高分辨率、高灵敏度以及可以与其他技术（如质谱、Western blot 等）结合等优点。
本文将介绍SDS-PAGE的原理、实验步骤和关键注意事项，并提供相关的Markdown文本格式输出，以便读者在实验中参考。
2. 原理SDS-PAGE的原理基于SDS的作用。
SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，能够使蛋白质在水溶液中均匀地带上负电荷，同时使蛋白质变性并展开成线性构象。
在电泳过程中，SDS包裹在蛋白质中，使蛋白质的电荷密度保持均一，从而使蛋白质的迁移速率仅与蛋白质的分子量有关，而与蛋白质的电荷无关。
SDS-PAGE通常在聚丙烯酰胺凝胶上进行。
聚丙烯酰胺是一种化学稳定性强的凝胶材料，通过聚合物的交联形成网状结构。
在凝胶电泳过程中，根据蛋白质分子量的不同，蛋白质能够在凝胶孔隙中以不同程度的速率迁移。
3. 实验步骤3.1. 制备凝胶1.准备1.5 M的Tris缓冲液，pH 8.8。
2.准备汀凝胶的原液，将30%丙烯酰胺溶液、1.5 MTris缓冲液和10%过硫酸铵按照体积比例（29:1:10）混合均匀。
3.快速加入TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）溶液至原液中，并迅速倒入凝胶模具中。
4.在凝胶模具上方加入异丙醇以防止凝胶表面生成凝胶。
3.2. 样品处理1.取适量的蛋白质样品。
2.加入相应的样品加载缓冲液（含有SDS和还原剂，以及测量样品体积比例的溶液）。
3.在冰上煮沸5分钟，使蛋白质样品变性并带上负电荷。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE作用：用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。
作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是196 7年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
作用：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
补充信息聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、具体实验操作
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻 璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要 充分.
四、实验结果分析
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
三、具体实验操作
3. 实验步骤
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形 瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米 左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性 完成,避免产生气泡.
三、具体实验操作
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置 40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µ l标准蛋白溶解液于EP管内， 再加入10µ 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 l
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移 率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即 可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块 凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
图.1 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
图.2 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框
四、学生观看实验录像
下面请同学们先观看录像，注意SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离蛋白的基本原理和基本操作， 仔细观察预备液及电泳缓冲液的配制、制胶、 灌胶、加样、电泳及染色料、
材料：细菌培养物 试剂：30%丙烯酰胺1mL；1.5mol/L Tris(PH8.8)； 1.0mol/L Tris(PH6.8)；10%SDS；10%过硫酸铵； TEMED；2×SDS凝胶加样缓冲液； pH8.3 TrisGly电极缓冲液；1%琼脂糖溶液； 0.05％考马斯亮兰R250 仪器：超净工作台；离心机；移液器；大培养皿； 垂直电泳槽；稳压稳流电泳仪 ；脱色摇床
五、该实验的一些重点问题和难点
2、不连续体系SDS- PAGE电泳中的样品浓缩效应： 、不连续体系 电泳中的样品浓缩效应： 电泳中的样品浓缩效应 凝胶孔径不连续性：在2层凝胶中样品/浓缩胶为大孔 径胶，分离胶为小孔径胶；在电场作用下，被分离物 在大孔径中移动遇到阻力小，移动速度快，当进入小 孔径胶时，被分离物移动受到阻力大，移动速度变慢， 因而在两种胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使 样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
五、该实验的一些重点问题和难点
2、不连续体系SDS- PAGE电泳中的样品浓缩效应： 、不连续体系 电泳中的样品浓缩效应： 电泳中的样品浓缩效应 电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是 自动形成的。电泳开始后，由于前导离子的迁移率最大，就 会很快超过被分离物，因此在快离子后面，形成一个离子浓 度低的区域，这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度 使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动。当前 导离子、被分离物和尾随离子的移动速度相同时，建立一种 稳定状态，这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而 又不断向正极移动的界面，这就是样品被浓缩的中间层。压 着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：莱姆利(emmli)于1970年创建的含十二烷基硫酸钠(SDS)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质方法。
向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS，SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。
是分析蛋白质和多肽、测定其分子量等常用的方法。
可测定蛋白质分子量.其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功,此法测定时间短,分辨率高,所需样品量极少(1～100μg),但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质,某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此时测定结果就不准确.2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 名词解释
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，该技术通过在凝胶电泳过程中使用一种带有离子表面活性剂SDS（十二烷基硫酸钠）的聚丙烯酰胺凝胶，可以将蛋白质分子进行线性化处理，从而使其在电场中按照分子质量大小进行迁移，最终实现对蛋白质的分离和分析。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是生物化学和分子生物学领域中最重要的实验技术之一。
它被广泛应用于蛋白质的分离、鉴定和定量分析，并且对于蛋白质的结构和功能研究具有不可替代的作用。
在科学研究、医学诊断和生物工程领域中都有着重要的应用价值。
本篇文章将从以下几个方面来介绍sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，包括其原理、应用、实验操作步骤以及相关的意义和发展趋势。
一、原理sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的原理主要包括以下几个方面：1. SDS线性化蛋白质：SDS是一种带有强烈负电荷的表面活性剂，在凝胶电泳过程中，SDS可以与蛋白质分子中的亲水残基相结合，并使蛋白质分子呈线性状态，从而使蛋白质的电泳迁移速率与其分子质量成正比。
2. 分子质量分析：在电泳过程中，由于SDS的作用，所有蛋白质分子都被线性化处理，并且蛋白质分子的迁移速率只与其分子质量大小有关，因此可以根据蛋白质在凝胶中的迁移距离来推断其分子质量。
3. 分离效果：由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质进行了线性化处理，因此不同分子质量大小的蛋白质分子可以在凝胶中得到有效分离，形成清晰的电泳带。
二、应用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术主要应用于以下几个方面：1. 蛋白质分离与鉴定：通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，可以将混合蛋白质样品有效地分离并形成清晰的电泳带，便于后续的蛋白质鉴定和分析。
2. 蛋白质定量：在实验室中，可以利用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质样品进行定量分析，根据样品中的蛋白质含量来确定实验结果。
3. 蛋白质结构和功能研究：通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可以实现对不同蛋白质的分子量测定，为进一步的结构和功能研究提供重要数据支持。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在电场的作用下，小分子蛋白质可以 容易地通过凝胶孔径，而大分子蛋白 质则受到较大的阻力，无法通过，从 而实现蛋白质的分离。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
蛋白质组学研究
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质 组学研究中常用的分离方法，可用于 蛋白质的表达、纯化、鉴定和功能研 究。
实时监测与数据分析
引入实时监测技术和数据分析软件，可以实时监测电泳进程并获 取更准确的数据，为后续分析提供有力支持。
应用拓展
临床诊断
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳在临床诊断中发挥着越来越重要的作用， 可用于检测和鉴别疾病相关的蛋白质标志物。
生物医药研究
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物医药研究中广泛应用于蛋白质组 学、药物筛选和生物标志物发现等领域。
sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳
目 录
• SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳简介 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果分析 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的发展趋势
01 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电 泳简介
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的定义
准备凝胶制备所需材料
根据实验需求，准备适量的丙烯酰胺、 N,N'-甲叉双丙烯酰胺、SDS、 TEMED等材料。
制备缓冲液
根据电泳条件选择适当的缓冲液，如 TAE或TBE，并配置适量的浓度。
准备样品
将待测样品进行适当处理，如超声破 碎或离心取样。
操作步骤
制备凝胶
点样
按照一定比例将丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙 烯酰胺、SDS、TEMED混合，加入适量的 水搅拌均匀后倒入电泳槽中。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
试剂配制
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙 烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置 棕色瓶中。 4℃，1-2月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取 Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取 Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0， 最后用蒸馏水定容至100ml
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m
R
+
K
其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
聚丙烯酰胺具有神经毒性， 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
？
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后, 需在其上加一层水,为什么? • 电极缓冲液中甘氨酸的作用? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶 中均含有TEMED和AP,试述其作用? • 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分 钟?
一抗
1 2 3 4 5 把膜从冰箱中取出，RT ，30min。 注： 封闭 液可回收 四个角蘸点水铺好保鲜膜后，加1：100的一抗 500ul（抗体稀释液495ul+5ul mouse p65抗体） 于保鲜膜上 蛋白面朝下，使尼龙膜和一抗充分接触。注避免 产生气泡，如有气泡，可用镊子将膜的四角轻轻 提起，排出气泡 盖上玻璃平皿，RT下孵育2hours TBST 10min×2 ； TBS 10min×1
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有 电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、 操作步骤
固定玻板
制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目 的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有 气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶 （10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶 （5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小 刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上 角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用 脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧
插入梳子
加缓冲液
加 样
电泳
剥胶
五、实验结果
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
• 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 而聚合的速度影响交联孔径的大小， 而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚 合时必须保持温度恒定， 合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温 度。 分子氧的存在会阻止碳链的延长， • • 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 • • 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶 的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和 的化学聚合，所以应选择高纯度的 、 和 AP。 。
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 应选择合适的AP和 • 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的 和 TEMED浓度使聚合时间控制在 浓度使聚合时间控制在30—60min内较好， 内较好， 浓度使聚合时间控制在 内较好 过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的 畸变。 畸变。 • pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在 只能以游离碱的形式发挥作用， 只能以游离碱的形式发挥作用 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发 产生自由 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 •
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
• 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着 度及孔径大小的主要因素。 为凝胶溶液中单体和交联剂的 度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的 总质量浓度， 为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 质量分数。 质量分数。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一,实验目的 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 聚丙烯酰胺凝胶电 掌握 泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE , )的工作原理和操作方法
二,实验原理 不同蛋白质具有不同的分子量, 不同蛋白质具有不同的分子量,并在 一定的pH溶液中带有不同的电荷 溶液中带有不同的电荷. 一定的 溶液中带有不同的电荷.但 经过SDS处理后的蛋白质,分子表面 处理后的蛋白质, 经过 处理后的蛋白质 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量 大小而与其所带电荷的性质无关. 大小而与其所带电荷的性质无关.
6. 上样:将样品梳拔出,用电极缓冲液 上样:将样品梳拔出, 冲洗样品孔. 冲洗样品孔.样品与样品缓冲液按一 定比例混合好. 定比例混合好.用微量注射器加入加 样孔,加样量为20l. 样孔,加样量为 . 7.电泳:100V恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 电泳: 电泳 恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 到浓缩胶和分离胶界面, 到浓缩胶和分离胶界面,然后调电压 至120V,再恒压电泳,约1.5 h,待染 ,再恒压电泳, , 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 停止电泳.取下胶板, 停止电泳.取下胶板,将胶片置于白 瓷盘内. 瓷盘内.
4. 制备浓缩胶:待胶凝固后(胶与水之间有 制备浓缩胶:待胶凝固后( 一清晰界面), 将水倒掉, 一清晰界面), 将水倒掉,用ddH2O冲 冲 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 倒入浓缩胶插好样品梳, 倒入浓缩胶插好样品梳,注意避免气泡滞 留在梳子与胶液的界面, 放置约15 留在梳子与胶液的界面,30 ℃放置约 min,直至使浓缩胶凝固. ,直至使浓缩胶凝固. 5. 电泳:将胶模装好,去胶条后,装入电泳 电泳:将胶模装好,去胶条后, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板 矮板在内). (矮板在内).
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。
二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。
通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。
三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。
四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。
五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。
根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。
通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。
六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。
本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰氨凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)
实验报告
一、实验目的
1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理
1、电泳：
(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：
①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；
②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；
③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；
④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；
⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；
⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；
⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；
⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
(1)定义
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
(2)SDS的作用
SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小
(3) SDS-PAGE分类：
¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法
②光聚合法
①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），
它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
②光聚合：
），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基
催化剂是核黄素（VB
2
再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。
光聚合形成的凝胶孔径较大，且不
稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
聚合反应：
(5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
①聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥
联结在一起；
②链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；
③网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；
三、器材试剂
试剂贮备液：
1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。
4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。
5、核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。
6、蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。
7、电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。
8、过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。
9、溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。
10、脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。
11、蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水80ml，溶解后混合之。
12、过氧化物酶染色液：
1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。
抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。
2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。
0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。
30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。
邻联茴香胺（o─dianisidine）
100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。
用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
四、实验步骤
1.根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶。
1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。
把玻璃板在灌胶支架上固定好。
3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液1，3和水放在一小烧杯中，过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将过硫酸铵溶液并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻璃板中。
玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。
胶液注到离玻璃板口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。
4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。
浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟。
5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会。
6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液。
7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则。
8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡。
9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳。
10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。
11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果。
12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染。
【注意事项】
1、固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
2、凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
3、水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。
4、凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
5、样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
6、要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
7、注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。
8、为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
9、剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
五、思考题
1、解释SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的基本原理。
2、样品溶解液中含有哪几种主要成分？各成分的作用是什么？
3、影响电泳结果的因素主要有哪些？为什么？。