流式细胞术实验方法及应用描述

藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（红外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
置 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
激发光波长（nm ）
异硫氰酸（FITC） 488 发射波长(nm) 525（绿）
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加
入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前
兔抗小鼠
小鼠
很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
接抗体，只能采用此方法。 直接标记是在标记时加入连接着荧光素
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
3. 对激光有强的吸收----降低背景噪音。
4. 激发光谱和发射光谱之间差距大---减少
干扰。
5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析：
双百度文库分析：FITC与PE
三色分析：双色分析+PE-CY5
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 离心 单细胞悬液。
醇乙脱水： 70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ 100％醇乙 →90%→80%→70％→50％ →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇，蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃，15-30min
冰PBS 过滤 离心 液
酶消化法
组织器官
机械法
单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
（1）、酶消化法
组织块洗去血液
37℃，15-30min
剪成小块
胰蛋白酶
100目 单
含血清的培养基 PBS 洗2次
钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
细胞悬液。
（2）、机械法
单细胞制备仪
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤
单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，置于4℃ 冰箱中静置 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
流式细胞术实验方法及应用
何玉萍
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm）
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒， 经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细 胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。