免疫学实验技术和荧光定量PCR课件
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荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件
灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义
荧光定量PCR原理及操作步骤ppt课件
参比荧光：管家荧光ROX
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
ROX校正效果
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
未结合SYBR Green 1 dye
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
ROX校正效果
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未结合SYBR Green 1 dye
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
(完整)PPT荧光定量PCR精品PPT资料精品PPT资料
实验七 荧光定量PCR
简介
定量PCR：检测PCR反应指数期某一点的PCR产物数量，由此 确定初始模板的数量。
荧光定量PCR （real-time Q-PCR）：是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。
1996年由 Applied Biosystems公司推出该技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点
熔解曲线分析引物二聚体
Product of Interest Primer dimers
TaqMan探针法
➢ 5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等 ➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与
Q分开，发荧光 ➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光定量PCR的优点
❖ 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增 ❖ 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 ❖ 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，
也可用于定量，确定起始DNA拷贝数
荧光定量PCR扩增曲线
✓ 荧 光 定 量 PCR扩 增 曲线并非标准的指 数曲线，而是S形曲 线，并可分为反应 早期、指数期和线 性期和平台期。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
TaqMan探针法
荧光标记物的选择
不同定量方法的比较
定量方法
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未 知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线 确定样本中基因的拷贝数或浓度
相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参 照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个 样本中基因表达水平的高低变化
简介
定量PCR：检测PCR反应指数期某一点的PCR产物数量，由此 确定初始模板的数量。
荧光定量PCR （real-time Q-PCR）：是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。
1996年由 Applied Biosystems公司推出该技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点
熔解曲线分析引物二聚体
Product of Interest Primer dimers
TaqMan探针法
➢ 5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等 ➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与
Q分开，发荧光 ➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光定量PCR的优点
❖ 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增 ❖ 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 ❖ 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，
也可用于定量，确定起始DNA拷贝数
荧光定量PCR扩增曲线
✓ 荧 光 定 量 PCR扩 增 曲线并非标准的指 数曲线，而是S形曲 线，并可分为反应 早期、指数期和线 性期和平台期。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
TaqMan探针法
荧光标记物的选择
不同定量方法的比较
定量方法
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未 知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线 确定样本中基因的拷贝数或浓度
相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参 照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个 样本中基因表达水平的高低变化
荧光定量PCR基础原理ppt课件
荧光定量PCR基础原理
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探针完整时，汇报基团发射荧光信号被近距离淬灭基 团吸收；伴随PCR进行，Taq酶在链延伸过程中碰到与 模板结合探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解 ，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应 体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
荧光定量PCR基础原理
荧光定量PCR基础原理
11/39
普通PCR技术检测模式
普通PCR仪器扩增， 约2.5小时
琼脂糖凝胶电泳， 约1小时
阴性
无法定量
样品检测结果
阳性
EB染色，约20分钟 紫外成像
荧光定量PCR基础原理
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实时荧光定量PCR检测模式
荧光定量PCR仪器扩 增，约2小时
光滑S型指数曲线， 阳性
检测过程有实时监测 数据
Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能 量传递）原理设计。
荧光定量PCR基础原理
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TaqMan探针法-水解探针
PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性荧光 探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在 两条引物之间。
TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标识，探针 5′端标识有荧光汇报基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标识有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。
绝对定量
病原载量定量
GMO成份评定
残留DNA测定
相对定量
基因表示差异比较
治疗伎俩效果评定
荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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SYBR Green I荧光染料作用原理
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
齐全版(荧光PCR技术)ppt课件
实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
详细描述
VS
荧光定量PCR技术在病原体检测和耐药基因研究中具有高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，有助于及时诊断和治疗相关疾病。
详细描述
针对不同病原体，荧光定量PCR技术可以设计特异性引物和探针，实现对病毒、细菌、寄生虫等病原体的快速检测。同时，该技术还可以用于耐药基因的检测和研究，为抗生素的合理使用和疾病治疗提供科学依据。
总结词
荧光定量PCR技术在基因表达分析中具有重要作用，能够检测基因在不同条件下的表达水平，有助于深入了解基因的功能和调控机制。
详细描述
通过荧光定量PCR技术，可以设计特异引物，对目的基因进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号，从而计算出目的基因的起始拷贝数和相对表达量。这种方法广泛应用于基因表达谱分析、转录因子研究、药物筛选等领域。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
荧光定量PCR技术概述 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术的应用 荧光定量PCR技术的优缺点 荧光定量PCR技术的实验操作流程 荧光定量PCR技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸，实时监测PCR产物量的变化，实现定性和定量分析的技术。
根据实验需求，准备PCR引物、探针、DNA模板等必要材料。
对采集的样品进行预处理，如DNA提取、纯化等，确保样品质量满足PCR扩增要求。
实验准备和样品处理
样品处理
实验材料准备
按照PCR反应体系的要求，将引物、探针、DNA模板等组分加入到反应液中。
反应液配制
确保反应液中的组分充分混匀，以保证PCR扩增的均匀性。
VS
荧光定量PCR技术在病原体检测和耐药基因研究中具有高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，有助于及时诊断和治疗相关疾病。
详细描述
针对不同病原体，荧光定量PCR技术可以设计特异性引物和探针，实现对病毒、细菌、寄生虫等病原体的快速检测。同时，该技术还可以用于耐药基因的检测和研究，为抗生素的合理使用和疾病治疗提供科学依据。
总结词
荧光定量PCR技术在基因表达分析中具有重要作用，能够检测基因在不同条件下的表达水平，有助于深入了解基因的功能和调控机制。
详细描述
通过荧光定量PCR技术，可以设计特异引物，对目的基因进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号，从而计算出目的基因的起始拷贝数和相对表达量。这种方法广泛应用于基因表达谱分析、转录因子研究、药物筛选等领域。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
荧光定量PCR技术概述 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术的应用 荧光定量PCR技术的优缺点 荧光定量PCR技术的实验操作流程 荧光定量PCR技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸，实时监测PCR产物量的变化，实现定性和定量分析的技术。
根据实验需求，准备PCR引物、探针、DNA模板等必要材料。
对采集的样品进行预处理，如DNA提取、纯化等，确保样品质量满足PCR扩增要求。
实验准备和样品处理
样品处理
实验材料准备
按照PCR反应体系的要求，将引物、探针、DNA模板等组分加入到反应液中。
反应液配制
确保反应液中的组分充分混匀，以保证PCR扩增的均匀性。
荧光定量PCR的原理及其应用PPT课件
操作复杂
荧光定量PCR的操作过程相对复杂， 需要专业人员进行操作。
荧光染料和探针的干扰
荧光染料和探针有时会对PCR扩增产 生干扰，影响结果的准确性。
样本中存在抑制剂的可能性
某些样本中可能存在PCR抑制剂，影 响荧光定量PCR的检测结果。
05 荧光定量PCR的发展前景
技术改进与优化
01
02
03
高效多重检测
合成新的DNA链。
的DNA链结合，产生荧
光信号，通过检测荧光
信号的积累，可以实时
监测DNA的扩增过程。
02 荧光定量PCR的种类
SYBR Green I法
原理
SYBR Green I是一种荧光染料，可以与双链DNA结合并发出荧光信号。在PCR扩增过程 中，随着DNA的合成，SYBR Green I荧光信号会逐渐增强，通过监测荧光信号的增强程 度可以实时监测DNA的合成。
通过荧光定量PCR技术，可以检测肿瘤组织中特定基因的 表达水平，从而评估肿瘤的恶性程度、转移风险和预后情 况。
在传染性疾病诊断中的应用
传染性疾病的病原微生物种类繁多，荧光定量PCR技术可以用于快速检测和鉴定 病原微生物，为传染性疾病的诊断提供准确依据。
通过荧光定量PCR技术，可以检测出病原微生物的核酸序列，从而确定传染性疾 病的病原体类型、感染部位和传播途径。
结合微流体技术和数字 PCR技术，实现单分子检 测，提高检测的灵敏度和 分辨率。
纳米材料增强
利用纳米材料增强荧光信 号，降低背景噪声，提高 检测的信噪比。
基因编辑技术
结合基因编辑技术，对基 因组进行定点编辑和改造， 为疾病治疗和基因治疗提 供新手段。
未来发展方向与展望
临床应用拓展
荧光定量PCR原理及应用 ppt课件
2020/12/17
SYBR Greeppnt课件I 工作原理
17
2020/12/17
ppt课件
18
2020/12/17
ppt课件
19
• 一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信
号的产生，随着循环数增加，荧光信号不
断积累。
2020/12/17
ppt课件
20
2020/12/17
ppt课件
21
• 模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和
2020/12/17
ppt课件
12
• 相对定量：是通过与内参基因Ct值之间的相
差来计算表达基因的差异，也称之为2 -ΔΔCt
•。
2020/12/17
ppt课件
13
2020/12/17
ppt课件
14
• 荧光定量PCR的理论基础：均基于荧光共振
能量转移（FRET)的原理，即当一个荧光基 团与一个淬灭基团的距离邻近时（＜10nm)， 就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧 光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使
其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭 基团分开，淬灭作用即消失。
2020/12/17
ppt课件
15
2020/12/17
ppt课件
16
• 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR
荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地 掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而 不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号 的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
• CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定
的域值时所经历的循环数被称为 CT 值 。
2020/12/17
实时荧光定量PCR技术ppt课件
斜率与扩增效率
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光定量PCR化学原理
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fபைடு நூலகம்st
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
《荧光定量PCR》幻灯片PPT
根据未 • 知样品的c 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
质粒 • DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。相对
定量指 • 的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变
化。
实时荧光定量PCR技术的原理及 应用
(Real time Quantitative PCR)
原理
• 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参加非 特异性的荧光染料〔如： SYBR GREEN I 〕或特 异性的荧光探针〔如： Taqman 探针〕，实时 检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的 荧光信号〔阈值〕时所需的循环次数： CT 值 〔 Cycle Threshold 〕；
•
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸〔DNA或
RNA〕序列通过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被
洗去。最后，根据方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测
序列〔即与探针互补的序列〕。
探针设计原那么
• 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论 上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确 保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时 先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 防止探针中多个重复的碱基出现，尤其是要防止4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连 时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一 个碱基。 7. 防止探针与引物之间形成二级构造。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
质粒 • DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。相对
定量指 • 的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变
化。
实时荧光定量PCR技术的原理及 应用
(Real time Quantitative PCR)
原理
• 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参加非 特异性的荧光染料〔如： SYBR GREEN I 〕或特 异性的荧光探针〔如： Taqman 探针〕，实时 检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的 荧光信号〔阈值〕时所需的循环次数： CT 值 〔 Cycle Threshold 〕；
•
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸〔DNA或
RNA〕序列通过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被
洗去。最后，根据方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测
序列〔即与探针互补的序列〕。
探针设计原那么
• 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论 上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确 保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时 先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 防止探针中多个重复的碱基出现，尤其是要防止4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连 时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一 个碱基。 7. 防止探针与引物之间形成二级构造。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
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ELISA
基本原理 方法种类 实验操作 应用 常见问题分析 写作实例
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA
基本原理
➢ 全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay） ➢ 原理： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附ห้องสมุดไป่ตู้”； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” ；
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
过程（简单了解）：
抗原制备： 商品化或自行表达
多克隆抗体制备
基础免疫：首次， 抗原用量大，用弗 式完全佐剂（含矿 物油,卡介苗等)。
加强免疫：第2次以后， 抗原量减半，多次，间 隔2-4周，用弗式不完全 佐剂(不含卡介苗).
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抗原的基本知识
定义：抗原（antigen）是能够刺激机体产生免疫应答的效应物质（抗体和 致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合的物质。
两个基本特性： 免疫原性（immunogenicity）：能够刺激机体产生抗体和效应T淋巴细胞的 免疫反应能力。 抗原性（antigenicity）：与免疫反应最终产物（如抗体和/或T细胞表面受 体）特异结合的能力。
完全抗原与半抗原
抗原表位（Epitopes）：抗原决定簇。 存在于抗原分子中，决定抗原特异性的基本结构 或化学基团。是与TCR/BCR及抗体结合的基本单位。
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抗体的基本知识
定义：antibody。指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细 胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
内容提要 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
➢ 抗原和抗体 ➢ ELISA ➢ Western blot ➢ 免疫组化（免疫荧光） ➢ Real Time PCR
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抗原的基本知识 抗体的基本知识 多克隆抗体 单克隆抗体
多克隆抗体制备
动物选择：
• 兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白） • 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） • 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠） • 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。 • 马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。 • 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA
方法种类 其他方法
双抗原夹心法、竞争法、捕获法、基于细胞法
放血制备血清：
可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
佐剂的作用机理： 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈
取血测效价： 加强免疫两次 或三次以后的第7 天取血。
促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
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多克隆抗体
抗原多个表位诱导多种B细胞克隆增殖与分化，产生多种抗体的混合物。
特点：
• 多抗是单抗的混合物，群体 综合的性质。
• 更容易捕捉抗原。 • 特异性相对较差：交叉反应 • 抗体的纯化、标记难。
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单克隆抗体
单个抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体。
什么情况下需要制备单克隆抗体？
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
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结构与功能： 1）重链轻链； 2）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补； 3）抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜
Fc受体结合，发挥不同的生物学效应。
应用
医学应用：
1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等。 2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。
科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等。
辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP） （3）酶反应的底物。
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ELISA
方法种类
直接法——检测Ag
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可 测定抗原总量。 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。 缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做 标记，费用相对提高。
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ELISA
方法种类
双抗体夹心法——检测Ag
将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶 标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物 的形成量与待测抗原成正比。适用于某些大分子的具有至少双 表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。 缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
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ELISA
方法种类
间接法——检测Ab
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。 优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分 析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。 缺点：交互反应发生的机率较高。
基本原理 方法种类 实验操作 应用 常见问题分析 写作实例
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ELISA
基本原理
➢ 全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay） ➢ 原理： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附ห้องสมุดไป่ตู้”； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” ；
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
过程（简单了解）：
抗原制备： 商品化或自行表达
多克隆抗体制备
基础免疫：首次， 抗原用量大，用弗 式完全佐剂（含矿 物油,卡介苗等)。
加强免疫：第2次以后， 抗原量减半，多次，间 隔2-4周，用弗式不完全 佐剂(不含卡介苗).
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抗原的基本知识
定义：抗原（antigen）是能够刺激机体产生免疫应答的效应物质（抗体和 致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合的物质。
两个基本特性： 免疫原性（immunogenicity）：能够刺激机体产生抗体和效应T淋巴细胞的 免疫反应能力。 抗原性（antigenicity）：与免疫反应最终产物（如抗体和/或T细胞表面受 体）特异结合的能力。
完全抗原与半抗原
抗原表位（Epitopes）：抗原决定簇。 存在于抗原分子中，决定抗原特异性的基本结构 或化学基团。是与TCR/BCR及抗体结合的基本单位。
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抗体的基本知识
定义：antibody。指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细 胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
内容提要 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
➢ 抗原和抗体 ➢ ELISA ➢ Western blot ➢ 免疫组化（免疫荧光） ➢ Real Time PCR
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抗原的基本知识 抗体的基本知识 多克隆抗体 单克隆抗体
多克隆抗体制备
动物选择：
• 兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白） • 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） • 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠） • 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。 • 马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。 • 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA
方法种类 其他方法
双抗原夹心法、竞争法、捕获法、基于细胞法
放血制备血清：
可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
佐剂的作用机理： 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈
取血测效价： 加强免疫两次 或三次以后的第7 天取血。
促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
多克隆抗体
抗原多个表位诱导多种B细胞克隆增殖与分化，产生多种抗体的混合物。
特点：
• 多抗是单抗的混合物，群体 综合的性质。
• 更容易捕捉抗原。 • 特异性相对较差：交叉反应 • 抗体的纯化、标记难。
抗原和抗体 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
单克隆抗体
单个抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体。
什么情况下需要制备单克隆抗体？
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
结构与功能： 1）重链轻链； 2）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补； 3）抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜
Fc受体结合，发挥不同的生物学效应。
应用
医学应用：
1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等。 2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。
科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等。
辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP） （3）酶反应的底物。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA
方法种类
直接法——检测Ag
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可 测定抗原总量。 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。 缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做 标记，费用相对提高。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA
方法种类
双抗体夹心法——检测Ag
将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶 标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物 的形成量与待测抗原成正比。适用于某些大分子的具有至少双 表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。 缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA
方法种类
间接法——检测Ab
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。 优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分 析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。 缺点：交互反应发生的机率较高。