重组蛋白包含体的复性

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重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究

表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述高应瑞（译）目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。

因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。

如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。

至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。

其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。

然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。

包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。

包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。

在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。

包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。

溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。

包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。

蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。

在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。

本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。

小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。

小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。

在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。

实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。

由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。

许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。

如何对包涵体蛋白进行表达与复性

如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。

一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。

8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。

二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。

三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。

四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。

1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。

包涵体蛋白复性的方法简介与操作

活性蛋白整体方案包涵体蛋白复性的方法简介与实验操作摘要：本文主要讲解了包涵体蛋白复性的技术的原理及操作方法，并附有相关案例。

包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。

蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA 等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。

包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。

此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。

包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。

盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。

SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。

另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。

这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。

二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。

常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。

重组包涵体蛋白质的折叠复性

重组包涵体蛋白质的折叠复性冯小黎*(中国科学院遗传学研究所人类基因组中心,北京100101)摘要综述了减少包涵体形成、包涵体分离和溶解以及包涵体折叠复性的策略及其最新进展.详细讨论了包涵体蛋白质折叠复性的基本原则、包涵体折叠复性促进剂和包涵体折叠复性方法.关键词包涵体,重组蛋白质,折叠复性学科分类号 Q51外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成.虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点,但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,这大大增加了基因工程蛋白质产物的成本.解决包涵体蛋白质复性率低的问题一方面可以从上游水平进行解决,另一方面则需要从生物工程下游技术角度去解决这一问题,以获得具有潜在临床和工业应用价值的蛋白质.1 减少包涵体形成的策略1 1 降低重组菌的生长温度降低培养温度是减少包涵体形成的最常用方法.较低的生长温度由于降低了蛋白质的合成速度、降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用,因此可减少包涵体的形成[1].1 2 促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应,在最适浓度范围内这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输[2].多醇或蔗糖不会渗透进细胞,它们对胞质蛋白质折叠的影响是由于它们所形成的渗透压会导致胞内抗渗物如甘氨酸甜菜碱的积累,而这些抗渗物具有与蔗糖类似的蛋白质稳定作用.其他促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇(诱导热休克蛋白的表达)、低分子质量的巯基或二硫化合物(影响细胞周质的还原态,从而影响二硫键的形成)和NaCl.也有报道认为丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达,当培养条件不佳时如供氧不足或pH控制不佳时易形成包涵体[2].2 包涵体的分离及溶解2 1 包涵体的分离包涵体分离的第一步是对培养收集的重组菌细胞进行破碎,所采用的破碎技术包括高压匀浆、超声波破碎等,为了提高破碎率,可以加入一定量的溶菌酶.包涵体高度抗剪切力,用以上破碎法破碎后仍可保持完整的结构.离心除去破碎上清液后的沉淀部分用含有低浓度的变性剂如脲和盐酸胍、去垢剂如Triton X 100、脱氧胆酸钠等化合物的缓冲液进行洗涤[3].如果需要对包涵体进行纯化,一般多采用蔗糖密度梯度离心法.2 2 包涵体的溶解包涵体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐,或去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等[4].对于含有半胱氨酸的蛋白质,还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸[5].温度一般选择在30 以促进溶解.此外,由于金属离子具有氧化催化作用,还常常需要加入金属螯合剂如EDTA、EGTA以除去金属离子.对于细胞周质内形成的包涵体,则需采用原位溶解的方法[6].包涵体的溶解需要打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽链伸展.各种溶解方法都各有利弊.一般来讲,盐酸胍优于脲,因为盐酸胍是较脲强的变性剂,而且脲中常含有的异氰酸盐或酯会不可逆地修饰蛋白质的氨基或巯基[7].*通讯联系人.Tel:010 ********,010 ********E mail:fengxiaoli@收稿日期:2000 09 25,接受日期:2000 11 033 重组蛋白质的折叠复性3 1 蛋白质折叠复性的基本原则3 1 1 一般原则:包涵体蛋白质折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程的竞争[8].由于蛋白质的折叠复性过程不会受到其他存在于同一复性环境中蛋白质的明显影响,一般情况下并不需要对待复性蛋白质进行纯化.然而一些情况下,由于非天然状态蛋白质的聚集常常会由于其中其他一些易于聚集蛋白质的存在而加强,或一些杂蛋白在与重组蛋白质一起复性时易形成杂合分子而聚集.因此,复性时最好使蛋白质达到一定的纯度.常用的纯化变性还原状态蛋白质的方法主要是还原剂和变性剂存在下的各种层析方法.为减少聚集,蛋白质的浓度应很低,一般在10~100g/L较好,这是蛋白质在体外折叠复性过程中一个十分关键的因素.变性剂去除速率在折叠中间物的积累和蛋白质聚集中起着重要的作用.复性应尽量不采用突然改变变性剂浓度的办法,因为这样会导致折叠中间体的聚集[7].不同的蛋白质应采用不同的变性剂去除速率[9].3 1 2 环境条件:应注意折叠复性的环境条件,如温度、pH值、离子强度、复性时间.折叠复性的温度范围为0~40 ,20~25 比较常用[7].在这个温度范围内,随着温度的升高,蛋白质的复性率和复性速度也提高;如果温度超出了这个范围,蛋白质折叠复性的效率则降低.同时也要考虑到较低的温度可以减少蛋白质的聚集反应.一般来说,碱性pH环境有利于蛋白质的折叠和二硫键的交换.盐类对蛋白质的稳定作用与它对蛋白质溶解性的影响有关,各种正负离子对蛋白质的稳定性和折叠复性的影响符合H ofmeister顺序.3 2 包涵体蛋白质折叠复性的促进剂包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为[4]:稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性.但事实上很难估计在蛋白质折叠复性过程中所加入的添加剂促进折叠的准确机制[9].一般而言,这些促进剂并未显示出对折叠复性过程的加速作用,但它们确实抑制或减少了导致蛋白质无活性的聚集反应.3 2 1 氧化还原转换系统:如蛋白质含有二硫键,在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分子质量巯基试剂的混合物,如谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺等.其还原型(1~3m mol/L)与氧化型的摩尔比为1 1到10 1[8].这样的氧化还原系统实际上给蛋白质形成的是一个还原环境.正确形成的二硫键在这样的环境中还是有可能被还原的.针对这种情况,还需在后续步骤加入一步强的氧化步骤,即加入过量的氧化型巯基试剂或采用Cu2+诱导的空气氧化,以保证形成稳定的二硫键.3 2 2 小分子质量添加剂:如盐酸胍或脲,以及其他一些化合物如烷基脲、碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂[10].蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用,如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集[9].加入浓度大于0 4mol/L Tris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率.浓度为0 5mol/L的L 盐酸精氨酸可大幅度提高包涵体蛋白的折叠效率[6,11].精氨酸可使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定,而使折叠过程向正确方向进行.但也有研究表明精氨酸略使蛋白质不稳定并可能干扰寡聚体蛋白质的缔合[4].3 2 3 聚乙二醇(PEG):Cleland等[12]在研究PEG对包涵体蛋白质折叠复性的影响中发现, PEG的存在能减少一些蛋白质的聚集.蛋白质的折叠通过一疏水融球态中间体,这种中间体的聚集将导致蛋白质回收率的降低.PEG通过与中间体特异地形成非聚集的复合物而阻止了疏水中间体的聚集.所有的折叠反应在PEG存在下具有相同的速率,复性率与PEG的分子质量及浓度相关. PEG对蛋白质折叠复性的促进作用与分子伴侣的作用机理相似.3 24 非离子型去垢剂尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂:如CHAPs、Triton X 100、磷脂、laurylmaltosid、Sarkosyl、磺基甜菜碱(NDSB)等对蛋白质复性有促进作用[13].使用去垢剂和表面活性剂的一个不利之处是由于它们能与蛋白质结合或形成胶束,故很难将它们完全除去.3 2 5 单克隆抗体:待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性,但仅该蛋白质特异的抗体具有明显的助折叠作用[14].研究发现,特异性抗体可以与待折叠蛋白的远离蛋白质活性中心的疏水区结合,从而有效地阻止了无活性聚集体形成.3 2 6 分子伴侣和折叠酶等:这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等.分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡,而且可在体外促进蛋白质的折叠复性[15].由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠复性后要除去,而这类蛋白质又十分昂贵,因此采用可回收利用的方法如固定化方法为好.3 2 7 人工伴侣:为了模仿分子伴侣GroEL GroES的作用,Rozema和Gellm an[16]将变性蛋白质首先加入到含去垢剂的溶液中以防止聚集,然后用环糊精cy clodextrin除去去垢剂以促进折叠复性.这种方法被称作人工分子伴侣促折叠技术.3 2 8 其他:多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的复性[11],而且具有稳定天然蛋白质的作用.Builder等[6]在折叠复性类胰岛素生长因子方法中,除了加入金属铜离子和镁离子、2mol/L脲、盐类如1mol/L NaCl、DT T外,还加入了乙醇、甘油等.短链醇类、高渗物等可以有效降低聚集体的形成,这可能归结为它们对蛋白质的稳定作用.3 3 包涵体蛋白质折叠复性方法一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点:a 活性蛋白质的回收率高;b 正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离;c 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品;d 折叠复性方法易于放大;e 复性过程耗时较少[17].就商业应用而言,要求折叠复性过程必须快速、低成本、高效.虽然蛋白质的折叠复性已有很多方法,但针对每一种蛋白质仍需通过实验摸索出最佳的方法.3 3 1 透析、稀释和透滤复性法:这三种方法是最传统的也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法,这三种方法各具特点[4].透析法耗时长,易形成无活性蛋白质聚集体.透滤是借助超滤实现复性的方法.该法速度较快,但由于蛋白质在超滤过程中易在膜上聚集变性(膜污染),从而限制了这种方法的应用.稀释法简单,也较透析、透滤法有效,但处理的料液量大,不利于复性方法的工业放大.目前稀释法主要有一次性稀释、分段稀释和连续稀释三种方式.分段稀释法和连续稀释法的复性回收率要高于一次性稀释法.分段稀释法一般采用两步稀释法,即先将变性剂的浓度降至一个中间浓度,最后再完全除去;或者是将强变性剂改为弱变性剂,最后再完全除去变性剂.3 3 2 已变性多肽的二硫键形成方法:对于具有二硫键的蛋白质,由于在包涵体中其二硫键(分子内或分子间)多有错配,复性时还涉及正确二硫键的重建.目前,正确二硫键的形成方法主要有以下几种[5]:a 空气氧化法,一般是利用空气中的氧气在折叠期间氧化巯基,痕量金属离子如Cu2+的存在可具有催化作用[10,14].此法简单,成本低,但复性率低且氧化过程难以准确控制.b 加入氧化还原转换试剂,如还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽等.c 复性前,加入氧化型谷胱甘肽,可使得氧化型谷胱甘肽与还原的蛋白质半胱氨酸之间形成二硫复合物,然后通过在复性过程中除去谷胱甘肽和变性剂,并加入低浓度的半胱氨酸取代蛋白质 S S 谷胱甘肽中的谷胱甘肽而使二硫键正确形成.d 用还原试剂或亚硫酸纳/连四硫酸钠使变性蛋白质磺化以保护巯基,复性时加入少量的还原试剂即可移去保护基团而使二硫键正确配对.e 加入DTT等还原剂.3 3 3 吸附复性法:将变性蛋白质吸附到某种介质上可以有效地抑制蛋白质分子间的非特异性相互作用,从而提高蛋白质的复性率.肝素琼脂糖层析法、金属螯和层析法等是实现吸附复性的有效方法.将单抗、分子伴侣等蛋白质的亲和配基固定在凝胶介质上促进蛋白质的折叠复性[14,15],也是一种吸附复性法,只不过介质上固定的配基单独也具有促进折叠的作用.也有将变性的蛋白质吸附到CNBr活化的琼脂糖凝胶Sepharose上而实现蛋白质的复性的报道,只是洗脱条件苛刻,难以保证蛋白质的回收率且步骤繁琐.离子交换层析、疏水相互作用层析等吸附纯化技术亦是很有效的吸附折叠复性法.3 34 凝胶过滤层析复性法:凝胶过滤层析除了可进行缓冲液交换式的蛋白质复性外,亦可对蛋白质进行一定程度的纯化[18].凝胶过滤层析已成功地用于许多蛋白质的复性.但在柱中进行缓冲液交换时,蛋白质可能会发生聚集现象.3 3 5 高蛋白质浓度下的复性方法:在高蛋白质浓度下实现蛋白质折叠的高产率,目前有几种成功的例子.一种是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白质加入到复性缓冲液中[19],使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性.一种是采用温度跳跃式复性,即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集体的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性[1].另外,还可以通过优化方法选择稀释法中变性剂的终浓度.凝胶过滤层析也可以实现高蛋白质浓度下的蛋白质的折叠复性,此外,吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用于高浓度蛋白质的复性.3 3 6 反胶束复性法[20]:由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性,运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束中,由于这样可使得蛋白质分子相互分离,减少了蛋白质折叠过程的聚集作用,通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化还原剂,则可使变性蛋白质复性.但表面活性剂对蛋白质具有变性作用.3 3 7 双水相法复性法[17]:Forciniti用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统使得包涵体的溶解与蛋白质的折叠复性在一步双水相技术操作中完成.由于PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用,这样正确折叠的蛋白质会不断进入到另一相中,直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡.参考文献1 Xie Y,W etl aufer D B.Control of aggregati on in protein refolding:the temperature leap tactic.Protein Sci,1996,5(3):517~5232 Georgi ous G,Valax P.Expression of correctly folded proteins inE.coli.Curr Opin Bi otechnol,1996,7(2):190~1973 Rudolph R,Bohm G,Lilie H,et al.Folding protei ns.In:Crei ghton T E ed.Protei 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body,recombinant protein,refolding*Corresponding author.T el:86 10 64871664,86 10 80494199,E mai l:fengxiaoli@Received:September25,2000 Accepted:November3,2000。

包涵体

包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

包涵体蛋白复性方法1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。

其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。

相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）5高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。

此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。

如果均失败只有换载体。

基因重组蛋白包涵体的复性研究

蛋白质与介质的疏水性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β，重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱（AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能

重组蛋白基础知识介绍

一，重组蛋白分类：
1，上清：His上清，His-Sumo上清，GST上清,
2，包涵体复性：His包涵体复性，GST包涵体复性
3，包涵体：His包涵体，GST包涵体
二，重组蛋白缓冲体系：
1，His上清NTA-0+500mM咪唑
2，His-Sumo上清NTA-0+500mM咪唑
3，GST上清1*PBS（包含10mMGST）
4，His 包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
5，GST包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
6，His包涵体6M盐酸胍，8M尿素,
7，GST包涵体6M盐酸胍，8M尿素
三，各种稀释液配方：
TE缓冲液（10mM Tris 5mM EDTA）
NTA-0 ( Tris,NaCl ,10% 甘油)
四，基础知识介绍：
1，His上清与His-Sumo上清的区别：
His上清是用pET28a载体表达的上清蛋白，上面只有一个His标签，His-Sumo上清是pET28a-Sumo载体表达的上清蛋白，Sumo蛋白上面有His标签。

Sumo是一种分子伴侣，大约18KD，可以与小分子量的蛋白相连接，增加蛋白分子量，增加免疫原性。

2，乳化稀释液
一般来说是重组蛋白用哪种缓冲体系，乳化稀释液就用那种稀释液。

NTA-0可以换成1*PBS缓冲液，His包涵体或GST包涵体缓冲液是6M盐酸胍用3M盐酸胍稀释，His包涵体或GST包涵体缓冲液是8M尿素用4M尿素稀释。

包涵体表达的蛋白的复性

包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化与复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点:较高的活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白;折叠复性方法易于放大等。

蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤:包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。

包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如2M尿素在50mM Tris,pH7、0-8、5,1mM EDTA中洗涤包涵体。

此外可以用温与去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。

同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl,使包涵体的纯度达到50%以上。

包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键,使多肽延伸。

盐酸胍就是较尿素强的变性剂,它能溶解尿素不溶的包涵体。

SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。

另外,从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键与链内的非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。

这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。

二硫键的形成与断裂就是可逆的,直到最有利的蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。

常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱,溶解度为用尿素溶解具有不电离,呈中性,成(8-10M)70-90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍(6-8M)溶解能力达95%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成。

包涵体蛋白质的复性研究进展

后基因组时代对基因结构与功能研究的需要使得基因的重组表达技术受到广泛的关注 [ 1] 。以大肠杆菌为宿主菌的原核表达系统因具有遗传背景清楚、易于操作和成本低廉等优点而被广泛应用于基因表达产物的结构与功能研究中。现已成功实现重组蛋白质在大肠杆菌中的高表达 , 然而 , 绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式 , 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作 , 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。迄今为止 , 还没有普遍适用于所有重组蛋白质的复性方案 , 包涵体蛋白质的复性已成为制约重组蛋白质生产的关键因素之一。近年来 , 随着对蛋白质折叠机理的深入研究 , 一系列的复性方法已被应用于包涵体蛋白质的复性过程 , 多种蛋白质的包涵体复性数据库 Refold 也在不断的完善中 , 其中已收录了近 500 种蛋白的 25 种复性方法 [ 2] , 建立该库的目标是从中寻找包涵体复性的共性 , 为表达纯化新的蛋白质提供参考。本文主要就目前效率较高的几种复性方法进行了探讨。 2 1 1. 1 包涵体蛋白质的复性策略将色谱技术应用于蛋白质的复性是最近研究较多并成包涵体蛋白质的复性机制由于包涵体溶解过程中高级结构被破坏 , 不具备生物学活性 , 因此有必要进行重组蛋白的复性。复性过程是变性蛋白的重折叠过程 , 一般通过降低包涵体变性液中的变性剂含量引发。蛋白质的重折叠不是一个单一的反应 , 需经过一系列的折叠中间体 , 最后形成蛋白质的天然构象 ( 图 1
包涵体。包涵
体中富含表达的重组蛋白质 , 它们经分离、洗涤、变性溶解以及复性等过程才能得到具有生物活性的蛋白质。近年来 , 随着对包涵体体外复性机制的深入研究 , 从包涵体中复性重组蛋白质已经有了很多的策略和方法。文章就有关工作的进展进行了综述。关键词包涵体 ; 折叠 ; 蛋白复性文献标识码 : A 文章编号 : 1005 8915( 2007) 04 0306 04 中图分类号 : Q 7

大肠杆菌包涵体表达重组蛋白的纯化和复性

A similar procedure was used by Gill et al. (9) to purify recombinant chicken and bovine growth hormones; by Marciani et al. (11) to purify recombinant envelope protein of HIV; and by Fountoulakis et al. (12) to purify a soluble human interferon γ-receptor.
Puriﬁcation and renaturation of recombinant proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies
Application Note
Key words: Puriﬁcation, renaturation, eukaryotic genes, recombinant proteins, inclusion bodies, E. coli, gel ﬁltration,
Ionexchange
HIC
Dilution or Dialysis
Fig. 1. General scheme for the extraction, solubilization and re-naturation (refolding) of eukaryotic proteins (recombinant proteins) produced as insoluble inclusion bodies in the cytoplasm of Escherichia coli cells. In some instances, the procedure used for refolding can result in a signiﬁcant puriﬁcation of the solubilized and denatured recombinant protein. The dotted squares indicate alternative methods for the refolding process.

包涵体蛋白溶解和纯化复性

IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、表达产物处理1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min6、12000g 4℃离心20min7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜二、包涵体的纯化1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用2、取样取离心上清，标记柱前3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱4、取样取柱后，标记柱后三、包涵体复性1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

用蒸馏水彻底清洗透析袋。

放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。

冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。

最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。

重组蛋白包含体的复性

重组蛋白包含体的复性[摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。

不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。

变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。

近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。

[关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins.Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。

包涵体复性注意事项和常见问题解析

包涵体复性注意事项和常见问题解析返回:包涵体复性介绍及包涵体复性操作方法包涵体复性注意事项1.最适pH值范围为8.0-9.0之间;2.温度适宜选择4℃;3.复性过程蛋白浓度不宜过大,一般为0.1-0.2mg/mL;4.复性时间一般为24-36小时;5.低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度;脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚集;Tris 对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解;6.首先要获得较高纯度的包涵体;7.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施;8.透析前后均要离心;9.包含体要彻底洗涤干净,洗涤液中加入适量Triton-X100;10.包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性;11.复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ;12.复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定13.TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除,在制药行业中一般不允许采用。

用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。

包涵体洗涤是纯化极为重要的一步,改变培养条件,再洗涤包涵体,有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带,这样后续的纯化就很方便了。

14.复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

包涵体复性常见问题分析包涵体复性原则低浓度,平缓梯度,低温。

怎样洗涤包涵体?通常的洗涤方法一般是洗不干净的,可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分,过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以一直稀释到合适的浓度,可以找到一个合适去除杂质的办法,其实这就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脱效果好。

对于尿素和盐酸胍该怎么选择尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。

包涵体蛋白体外复性的研究进展

17卷6期2001年11月生　物　工　程　学　报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.17　N o.6N ovember 2001收稿日期:2001204213,修回日期:2001207220。

基金项目:国家863项目(8632102209204201)资助。

3通讯作者。

　T el :86210264889350;Fax :86210264857285;E 2mail :hlhuang @ 包涵体蛋白体外复性的研究进展方　敏　黄华　3(中国科学院遗传研究所,北京100101)摘　要　外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。

包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。

近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。

最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集,提高活性蛋白的产率。

关键词　重组蛋白,包涵体,重折叠,复性,二硫键形成中图分类号　Q51 文献标识码　C 文章编号100023061(2001)0620608205 DNA 重组技术的发展使得蛋白质的生产进入了一个新时代。

大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。

然而,重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。

因此,自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来,人们就一直通过以下两个方向的研究以期望得到高活性、高产量的重组蛋白:(1)促进重组蛋白在大肠杆菌中的可溶表达:改变大肠杆菌的生长条件,或使重组蛋白与其它蛋白(如分子伴侣、折叠酶等)融合表达或共表达,或使重组蛋白分泌表达至细菌周质腔中等策略使重组蛋白在大肠杆菌中表达成可溶的生物活性形式。

(2)优化复性过程,将包涵体蛋白在体外复性得到生物活性蛋白。

工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化秦样本

第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表示和生产进入到一个新的时代。

大肠杆菌由于遗传背景清晰, 容易培养, 能够大规模发酵, 以及大量可供选择利用的克隆和高效表示载体而成为当前人们克隆和表示外源基因的首选菌株。

可是, 在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表示往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。

包涵体的形成虽有不少优点, 如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击, 而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解; 包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度, 有利于表示量的提高; 包涵体中杂蛋白含量较低, 且只需要简单的低速离心就能够与可溶性蛋白分离, 有利于分离纯化; 包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感, 易于破壁, 并与细胞膜碎片分离等。

可是, 无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质, 这一般是一件很困难的事情, 而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同, 因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。

现有的生物技术研究和产业化过程表明, 重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一, 是基因工程产品商业化的瓶颈, 也是一个世界性难题。

第一节包涵体形成的原因１．什么是包涵体所谓包涵体是指由于表示部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构( 如Cys含量高) , 如低电荷, 无糖基化等, 使得重组蛋白质与核酸, 周围杂蛋白质( 如核糖体元件、 RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、 ompF和ompA等) ,以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。

包涵体一般大小为0.1~3.0 μm, 具有很高的密度( 约 1.3 mg/ml) , 无定形, 呈非水溶性, 只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。

包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上, 它们没有生物学活性, 因为蛋白质分子没有形成正确的构象。

蛋白质复性

重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。

重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。

但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。

随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。

一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。

2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。

低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。

在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。

添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。

在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。

利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。

筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。

3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。

包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。

重组蛋白包涵体究竟是什么？

重组蛋白包涵体究竟是什么？包涵体定义重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，很容易形成不可溶、无生物活性的蛋白聚集体--包涵体。

包涵体须经过变性溶解后，在适当条件下复性形成天然的构象，才能得到生物活性蛋白，其生物活性得到恢复。

目前，大肠杆菌表达系统是生产重组蛋白最常用的表达体系，其重组蛋白的表达量可达细胞蛋白的50%，其他成分主要有一些杂蛋白（如 RNA聚合酶、核糖体组分、外膜蛋白等）、质粒 DNA、RNA 片断和脂质、肽聚糖、脂多糖等成分。

然而，重组蛋白的高表达往往导致形成高密度、不溶性蛋白颗粒，即没有生物活性的包涵体，需经过复性后方可恢复蛋白的生物学活性。

包涵体特点包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体形成原因通常情况下认为，包涵体的形成主要有以下几方面原因：（1）宿主的代谢水平会受到重组蛋白高表达的影响，蛋白没有足够的时间进行折叠；（2）二硫键的形成受到宿主细胞内环境的影响，或者因为二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度；（3）重组蛋白的氨基酸组成有差异。

一般来看，含硫氨基酸和脯氨酸的含量都与包涵体的形成呈明显的正相关；（4）环境因素，如重组蛋白所处的环境温度、培养基的成分、酸碱度、离子强度等都可影响包涵体的形成，有研究发现，温度与包涵体形成呈正相关，培养基养分不足时，包涵体也容易形成；（5）重组蛋白在真核生物中翻译后修饰需要相关酶类（如糖基化等），但因其是大肠杆菌的异源蛋白，缺少这种酶类，造成积累大量的中间体，从而形成包涵体沉淀；（6）细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的化学作用促使包涵体形成。

包涵体变性在包涵体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的，它们之间的聚集靠非共价键维持，包括疏水力、范德华力、氢键、静电引力等，唯一的共价键是半胱氨酸之间的二硫键。