细菌菌落总数的测定(精)
水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定
2.2 平板涂布法
先制作平板；
取样品（无菌水）0பைடு நூலகம்1ml放入平板 上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
平板涂布
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
混匀器
四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
培养皿标记
2. 接种平板
2.1 混合平板法
三、样品的稀释
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；
自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水 取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。 （也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
稀释平板培养菌落
1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
细菌菌落总数的测定(精)
A.3 无菌生理盐水
A.3.1 成分
氯化钠8.5g、蒸馏水1000mL
A.3.2 制法
称取8.5g 氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2．其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3．当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
五、 结果与报告
(一)菌落总数的计算方法
三、培养基和试剂（制法见附录A）
平板计数琼脂培养基、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水。
四、操作步骤
（一）样品的稀释
1.固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
6.及时将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
（二）培养
1．待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48 h±2 h。水产品30℃±1℃培养72 h±3 h。
2．如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按1条件进行培养。
3．若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定之老阳三干创作1 原理微生物活体数量的测定方法，经常使用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列分歧稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL）样品中的活菌数量。
2 资料和仪器平皿：φ90mm。
2.2无菌锥形瓶：容量250mL，500mL。
2.3无菌吸管：1mL（具0.01mL个度）,10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
2.4灭菌锅。
2.5恒温培养箱2.6涂棒。
2.7酒精灯。
2.8超净工作台。
2.9磁力搅拌器。
0漩涡振荡器3检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙↘方法② ↘↙4操纵步调4.1 培养基和试剂的配制平板计数琼脂培养基：LB 培养基（最经常使用）牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH 值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
无菌生理盐水的配制：称取8.5g 氯化钠溶解于1000mL 蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：固体样品： 称取10g 固体样品置于盛有90mL 无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不克不及触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
依照4.2.2操纵程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比方10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
4.2 平板接种与培养接种方法1：用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取分歧稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
菌落总数的检测方法
菌落总数的检测方法一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》三、说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
老师整理的实验报告 水处理微生物学标准实验报告10 实验十 细菌菌落总数(CFU)的测定
南昌大学实验报告学生姓名：学号：专业班级：实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩：实验十细菌菌落总数（CFU）的测定一、实验目的：1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2．了解培养基平板菌落计数原则二、实验基本原理：细菌菌落总数（CFU）是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后所生长的腐生性细菌菌落总数。
它是有机污染程度的指标，也是卫生指标。
在饮用水中所测得的细菌菌落总数除说明水有机污染的程度外，还指示该饮用水能否饮用。
但还应当指出的是，水源水中的细菌菌落总数不能说明污染的来源。
因此，结合大肠菌群数以判断水的污染的安全程度就更全面。
我国现行生活饮用水的卫生标准（GB5749－2006）规定：细菌菌落总数在1ml自来水中不得超过80个。
细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用适合它们的培养基才能将它们培养出来。
然而在实验工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机污染程度。
三、主要仪器设备及耗材：电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，电热培养箱，恒温水浴，冰箱，菌落计数器，放大镜，肉膏蛋白胨脂培养基，灭菌水，灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、实验步骤：1．水样的采取供细菌学检验用的水样，必须按无菌操作的基本要求进行采样，并保证在运送，贮存过程中不受污染。
为了要正确反映水质在采样时的真实情况，水样在采取后应立即送检，一般从取样到检验不应超过4小时。
条件不允许立即检验时，应存于冰箱，但也不应超过24小时，并应在检验报告单上注明。
（1）生活饮用水（自来水）先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，用灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
（2）池水、河水或湖水应取距水面10—15㎝的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即返回实验室检查，否则需放入冰箱中保存。
水样中细菌菌落总数的测定原理及方法电子教案(精)
《水处理微生物》教案教学重点教学难点无菌操作的实施各环节操作要求参考资料环境微生物陈剑虹、胡肖容主编科学出版社环境微生物周凤霞、白京生主编化学工业出版社一、训练目标1．能准确地采样和稀释样品，会制备平板。
2．能正确报告样品中的活菌数。
二、材料用具1.材料与试剂待测样品，牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，75%酒精棉球，试纸等。
2.仪器与用具天平，培养箱，干燥箱，超净工作台，水浴锅，称样瓶，吸管，培养皿，玻璃珠，试管，三角瓶，试管架，酒精灯，记号笔等。
三、训练操作规程1、稀释平板菌落计数法操作流程及技术要点操作流程操作技术要点训练准备提前分组，建议2人一组，每组准备以下物品：1．培养基：150mL牛肉膏蛋白胨培养基1瓶2．无菌水：9mL无菌水5～7支（吸取9mL蒸馏水装入试管中，所需数量根据样品中含菌量而定），然后塞上塞子培养基、无菌水采取高压蒸汽灭菌，于121℃灭菌20min3．1mL吸管8支，10mL吸管1支，培养皿9套。
用报纸包扎好，在干燥箱中于160℃灭菌2h取样超净工作台里操作，也可室内操作（需70%酒精净空，酒精灯无菌区操作）1．提前30min打开超净工作台风机和紫外线开关（注意：操作前关闭紫外灯）2．在超净工作台上，按无菌操作法准确量取待测样品1mL，注入到第1装有9mL无菌水试管中（注意：吸管吸液端不要接触到液面），振荡制成10-1菌悬液系列稀释再取1支吸管伸进10-1菌悬液吹吸数次，吸取1mL菌液注入到第2支装有9mL无菌水的试管中，混匀即成10-2菌液依此法按10倍序列稀释至适宜稀释度（图6-3）（注意：每换一个稀释度取1支新吸管）标记取12套培养皿，在皿底注明稀释度，每个稀释度重复3皿（含无菌水3加样取连续的3个稀释度菌液，用一支无菌吸管吸取1mL菌液加入对应的培养菌落计数一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度，算出同一稀释度3重复的菌落平均数，再根据公式求出样品的含菌量平板菌液注入量稀释释倍数平均同一稀释ml)(cf u/样品含菌数⨯=菌落度菌数报告1.若只有一个稀释度的平均菌落数在30～300，则该平均菌落数乘以稀释倍数即为该样品中的细菌总数2.若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300，则视二者之比如何来决定。
微生物 菌落总数 测定详细讲解
菌落总数测定详细讲解一、茵落总数的概念和测定意义菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。
菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态．以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据．二、茵落总数测定的几项说明1．菌落总数的测定。
是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。
由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。
3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。
因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。
但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。
习题作业-菌落总数测定(精)
习题作业一、选择题1、下列成分中不是配制测定空气中菌落总数的营养培养基的是（）。
A、蛋白胨；B、牛肉浸膏；C、乳糖；D、琼脂2、下列仪器设备中，（）不是撞击法测定室内空气中菌落总数所需要的。
A、干热灭菌器；B、冰箱；C、恒温培养箱；D、显微镜3、微生物检验过程中采用下列哪种操作（）方法：A ：定量方法B ：定性方法C ：化学方法D ：无菌操作二、填空题1、制备培养基用一般设备有：____________，___________，pH计或精密______ 。
2、营养培养基的制法：将各成分混合，，校正pH值至，过滤分装，℃， min高压灭菌。
3、食品中细菌________越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；__________越小，则食品含有致病菌的可能性越小。
须配合_______和______的检验，才能对食品做出较全面的评价。
三、应用题1、菌落总数的定义？2. 问题：菌落总数的检验程序？习题作业答案一、选择题1、C2、D3、D二、填空题1、量筒；三角烧瓶；pH试纸-2、加热溶解；7.4；121；20。
3、菌落总数、菌落总数、大肠菌群、致病菌三、应用题1.答：菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
2.答：1.检样（取样）2. 10倍系列稀释3. 选择2个~3个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内4. 每个培养皿中加入15~20mL平板计数培养基，混匀5. 在36摄氏度左右条件下经过48小时左右，计算各平板的菌落数。
6.计算菌落总数7.书写报告。
实验10 细菌菌落总数(cfu)的测定
实验10 细菌菌落总数(cfu)的测定实验目的：本实验的目的是学习菌落计数法，掌握在实验室中应用菌落计数法计算微生物群落密度的方法，并能够用测定结果进行稀释和百分率计算。
实验原理：菌落计数法是微生物计数的主要方法之一。
在菌落计数法中，必须用营养物质富含的培养基将待测物分散在培养物表面。
每个菌落表示一种单个细胞的后代，即在定期时间内营养物质经历漂浮、摇摆、分散和吸附过程之后，从单个细胞开始增殖的一系列后代。
菌落计数法要求在限定培养条件下进行培养，以便所有细菌都具有相似的生长速度。
通过计数所发现的菌落，可以确定样品中微生物的细胞数。
样本中存在多少个细胞需要明确。
这需要将样品稀释和分布在培养基表面，以便在计算菌落数量时可以获得数百个甚至数千个菌落。
在选择样品中细菌数量的范围时，需要考虑样品的反应过程，包括性状，物理化学性质和体积等。
如果样品中细菌数量太多，培养物中细菌细胞数量可能会达到最大值，使得菌落计数法无法对细菌数量达到该数量的范围进行有效计算。
在这种情况下，需要对样品进行稀释处理，并重新进行菌落计数分析。
实验仪器及设备：1. 工作台2. 恒温恒湿箱3. 倍增器4. 显微镜5. 称量器6. 移液器及移液枪7. 长管灯实验试剂：1. 琼脂培养基2. 生理盐水或磷酸缓冲液3. 蒸馏水实验步骤：1. 测定样品的细菌数量a. 准备预先测定样品细菌数量的干净培养皿。
盛放约20~25mL琼脂培养基并再次蒸过。
视情况在琼脂培养基底部标记好适当的标记，以便计算后将菌落数量乘以相应的稀释因子。
b. 准备带未知菌的样品。
在准备样品之前，如果需要允许不同环境的微生物在病原细菌的控制下合理发展和生长，可以使用磷酸盐缓冲液或生理盐水来制备样品。
c. 稀释样品。
通过取样采集适量的细菌并将其均匀地分配到适量的适当稀释液中并混合。
通过连续稀释，可以在一定的时间内以极低的细胞计数测定样品的细菌数量。
d. 移植培养。
使用无菌工具取适量稀释样品混合液置于标记好的琼脂培养基中。
菌落总数的测定
菌落总数的测定一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：GB4789.2-94《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》三、说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
任务一水中菌落总数的测定习题(精)
任务一水中菌落总数的测定习题一、名词解释：l. cfu:2. 无菌操作：3. 细菌总数：二、填空题：1. 生活饮用水标准检验方法微生物指标是 _____________ （写出GB代号）。
2. 生活饮用水菌落总数不得超过_________ 个/ml，总大肠菌群MPN不得检出。
3. 菌落总数测定时对水样进行_____ 倍递增稀释，一般选择_______ 个连续稀释度。
4. 应选取菌落数在_________ 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数作为菌落计数标准。
低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300 cfu的可记录为多不可计。
5. 灭菌的平板计数琼脂培养基应却至_____ C时倾注平皿。
6. 菌落总数测定时培养温度_______ °C,培养时间h 。
7. 稀释倍数越高，平板上的菌落数应越________ 。
三、判断题：1. 琼脂在46C以下会发生凝固，故常用于固体培养基的凝固剂和营养剂。
（）2. 菌落计数时，菌落数小于100 cfu 时，按"四舍五入"原则修约，以整数报告。
（）3. 菌落计数时，当平板内的菌落数过多（所有稀释度均大于300），但分布很均匀，可取平板的1/4计数，再乘以4作为该平板的菌落数。
（）4. 空白对照试验的平板上允许有菌落生长。
（）5. 菌落总数测定时，样品如果有包装，应用无水乙醇在包装开口处擦拭后取样。
（）四、简答题1. 平皿计数法（GB5750.12-2006）测定的细菌数量是样品中的实际菌数吗？为什么？2. 某样品菌落总数测定时，所有稀释度平板上都无菌落生长，试分析出现此结果的原因有哪些五、实验题：某种鸡厂对生产用水井的水样进行菌落总数测定时，按国家标准将水样处理及培养后，培养皿上生长的菌落数量记录如下：请回答下列问题：1. 对水样进行处理及培养条件是指什么？2. 本次实验选择的稀释度是多少？选择依据是什么？3. 列式计算并正确地对测定结果进行报告。
细菌菌落总数的测定注意事项
细菌菌落总数的测定注意事项检测过程中的注意事项：1、在GB 4789.2的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。
2、根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的估计，选择2~3个稀释度。
加入样品时要注意外来的污染。
3、为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在15min 内倾注培养基。
检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。
旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。
4、培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。
（倾注的温度：一般水浴和倾注温度在46±1℃，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡，过低会导致琼脂发生轻微凝固。
厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。
培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。
5、检验过程中还应该用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。
同时，检验过程中应在工作台上打开一块空白的平板计数琼脂，其暴露时间应与检验时间相当，以了解检样在检验过程中有无受到来自空气的污染。
6、每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。
食品：36±１℃，48±2h 。
饮用水：36±１℃，48±2h 。
水产品（指原生态、未加工的水产品）：30±１℃，72±3h。
(36℃培养和30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。
7、有时检样的稀释液中往往带有食品颗粒（如奶粉、坚果），在这种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作一检样对照将稀释液与PCA混合，不经培养，置4℃环境放置，在计数时用于对照。
另外也可以在已熔化而保温在46±1℃水浴内的平板计数琼脂中，按100ml加1ml0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。
细菌菌落总数的测定-V1
细菌菌落总数的测定-V1细菌菌落总数的测定是微生物学实验中的基础。
正确的测定方法对于微生物学实验的结果具有至关重要的作用。
下面就对细菌菌落总数的测定进行重新整理，以期能够对读者有所帮助。
一、实验介绍细菌菌落总数的测定是一种常见的微生物实验方法。
其主要目的是测定样品中细菌菌落总数，是微生物学实验中的基础方法之一。
二、实验步骤1、准备培养基：选用适当的培养基，如琼脂培养基、营养琼脂等，并进行无菌消毒处理。
2、准备样品：将需要检测的样品取适量并保存好，如牛奶、水等。
3、制备稀释液：将样品适当稀释后制备出几个不同浓度的稀释液。
4、涂抹培养基：将不同浓度的稀释液分别涂在培养基上并进行无菌操作。
5、培养菌落：将涂有不同浓度稀释液的培养基放入培养箱中，使其在适当温度下培养。
6、计数菌落：在菌落形成后，通过计数板或其他方法进行菌落数目的计数。
7、计算菌落总数：根据计数结果计算出原样品中的细菌菌落总数。
三、注意事项1、无菌操作：在实验中需要注意无菌操作，以避免细菌污染影响测定结果。
2、稀释液的制备：在制备稀释液时，需要考虑样品的浓度，并根据需要进行适当的稀释。
3、培养条件：在进行培养时，需要选择适当的温度和时间，以保证菌落的正常生长和形成。
4、计数方法：在进行菌落计数时，需要按照固定的规则进行计数，避免计数出现误差。
四、总结细菌菌落总数的测定是微生物学实验中的基础方法之一。
通过正确的实验步骤和注意事项，可以保证测定结果的准确性和可靠性。
在实际应用中，这种方法得到了广泛的应用，是微生物学领域中不可缺少的一种实验技术。
实验1.细菌总菌落数的测定
六、说明
为了保证实验结果能准确反映被检样品的真实情 况，检验时必须注意以下一些要求和规定： （1）检验中所用的所有器具都必须洗净、烘干、灭 菌，即不能存在活菌，也不能残留有抑菌物质。 （2） 应注意采样的代表性，如系固体样品，取样 时不应集中在一点，宜多采几个部位。固体检样 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 液。
（3）为减少样品在稀释时造成的误差，在连续递次稀释时， 每个稀释液应充分振荡，使其均匀（最好采用漩涡混合 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1支吸管。在进行 连续稀释时，应使吸管内的液体沿壁流入生理盐水中， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部附着的检液 溶于其内，造成误差。 （4）样品稀释液大多采用生理盐水，有时也用磷酸缓冲液 或0.1﹪的蛋白胨水。如果检样的含盐较高（如酱制品）， 0.1﹪ 稀释液也可采用无菌蒸馏水。用做样品稀释的液体，每 批都要做空白催找，以判断培养基、培养皿、吸管及空 气可能存在的污染。
（5）为了控制培养基的硬度适合细菌的生长，琼脂 含量选为1.5﹪ 含量选为1.5﹪。为了便于操作，有时在灭菌前， 就把培养基分装到不同的试管内，一般1 就把培养基分装到不同的试管内，一般1支试管 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 分应弃去，以免与菌落混淆而影响观察计数。 （6）为使菌落能在平板上均匀分布，将检液加入平 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 将平皿放在平面上，先前后左右地摆动，然后 按顺、逆时针的方向转动。混合时应多加小心， 不要使其溅到皿边和皿盖上。
微生物菌落总数的测定—菌落总数的计数方法
混合均匀。
•
6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温
箱内培养48±2h，水产品30±1℃温箱内培养72±3h。
•
如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生
长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼
脂培养基（约4毫升），凝固后培养。
• （二） 菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要
菌落总数的测定
三 、 材料
1、 食品检样 2、 培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 3、 其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培养箱等。
四、 流程
• 1、检样 • 2、做几个适当倍数的稀释液 • 3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入
灭菌平皿内 • 4、平皿内倾注15～20 mL琼脂培养基，混匀 • 5、36 ±1℃培养48±2小时或（24±2）小时 • 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 • 7、 计算菌落总数 → 报告
10-4
3.1x106
• 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜
计数范围内时，应以两者比值决定。若其比值小 于2，应报告两者的平均数；若大于等于2，则报 告稀释度较小的菌落数。
试样 稀释度
例次 10-2
10-3
1
380
52
平
2 均 526
205
菌
3 落 271
60
数
4
284
152
菌量
10-4 选定计数稀释度 /(个/g 或mL)
菌量
10-4 选定计数稀释度 /(个/g 或mL)
18
10-3
5.2x104
32
10-3，10-4
2.6x105
12
牛乳中细菌菌落总数的测定1(精)
四、检验程序
五、步骤
（一） 取样、稀释 和培养 （二） 菌落记录 方法
菌落总数 的计算 （三）
菌落计数 报告方法 （四）
按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 36 ±1℃培养48±2 h，能在平板计数琼脂上生长发育的 细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要 求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其 生理需求，故难以繁殖生长，所以染 程度的标志，也可以应用这一方法 观察细菌在食品中繁殖的动态，以 便对被检样品进行卫生学评价时提 供依据。
食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大， 食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性 越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较 全面的评价。
三、材料
1、牛乳样品
2、培养基 平板计数培 养基，无菌 生理盐水或 磷酸盐缓冲 液
3、其它 无菌培养皿， 无菌吸管， 电炉、恒温 培养箱等。
牛乳中菌落总数的测定
六、结果 一、目的 五、步骤
学习项目 设置
二、原理 四、检验程序
三、材料
一、目的
1、学习并掌握食 品中菌落总数测 定方法和原理。 2 、了解菌落总 数测定在被测样 品中进行卫生学 评价中的意义 。
二、原理
1、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后， 所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以 CFU/g （mL）来表示。一定条件包括培养基成分、培养温 度和时间、pH、是否需要氧气等。
实验十细菌菌落总数(CFU)的测定(精)
4）注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培 养基（用于河水样）立即旋摇培养皿，充分混匀。 方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反 方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。小心勿 使这个混合液体溅到培养皿的边缘。让平皿基于 水平位置放置至固化。 5）接种河水样的培养皿，倒置于37℃培养箱中培 养24h。
六、思考题
1、测定水中细菌菌落总数有什么实际意义？ 2、根据我国饮用水水质标准，讨论你这次的 检验结果。 3、本实验中哪些步骤属无菌操作？为什么？
4、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应 按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 5、如果全部稀释度的平均菌落数均不在30～300 之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。 6、菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数 报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位 有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为 了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示， 在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水 样的稀释倍数。
操作步骤图示振荡10min水样9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml10110210320ml20ml20ml倒培养基2五菌落计数及报告方法?一平板菌落数的选择?1进行平皿菌落计数时记下同一浓度的3个平板或2个的菌落总数计算平均值再乘以稀释倍数即为1ml水样中的细菌总数
实验十 细菌菌落总数 （CFU）的测定
(二) 稀释度的选择 l、首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当 只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可 用它作为平均值乘其稀释倍数。 2、若有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之 间，则应按两者的比值来决定。若其比值小于2， 应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小 的菌落数。 3、如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则 应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之。
菌落总数的测定
实验十三菌落总数的测定一、目的要求学习掌握菌落总数测定的基本原理和方法，了解食品上微生物的分布和繁殖动态。
二、实验说明菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。
但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作。
细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一君能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。
三、实验材料（1）培养箱 36±1℃（2）恒温水浴 46±1℃（3）天平。
（4）可调式电炉。
（5）吸管 1.0ml、10.0ml,标有0.1ml单位刻度。
（6）广口瓶 500ml，有盖。
（7）玻璃珠直径5mm。
（8）平皿皿底直径9.0cm。
（9）试管 18×200mm。
（10）酒精灯。
（11）试管架。
（12）研钵。
（13）灭菌刀和剪刀。
（14）灭菌镊子。
（15）酒精棉球。
（16）玻璃蜡笔。
（17）营养琼脂培养基。
（18）灭菌生理盐水、分装于试管中，每管9.0ml。
（19）食品检样。
四、检验程序（图9-1）五、方法步骤（一）检验稀释和培养1、以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水的广口瓶内（瓶内置有适量玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振摇或研磨用成1：10的均匀稀释液。
2、用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml，沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1：100的稀释液。
3、另取1.0ml灭菌吸管，按上述操作作10倍稀释，如此每递增稀释一次，即换1支1.0ml吸管。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2．若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
N =∑C/(n1+0.1n2)d…………………………………（1）
式中：
N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
三、培养基和试剂（制法见附录A）
平板计数琼脂培养基、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水。
四、操作步骤
（一）样品的稀释
1.固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）
菌落数（CFU）232，244 33，35
N＝∑C/(n1+0.1n2)d
＝232+244+33+35/[2+(0.1×2)]×10-2＝544/0.022＝24727
A.1.2制法
将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH7.0±0.2。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。
A.2磷酸盐缓冲液
A.2.1成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g、蒸馏水500mL
A.2.2制法
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
2.液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
3.用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
4．若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
5．称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
附录A
A.1平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基
A.1.1成分
胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL
《技能训练库》综合技能实训指导书
实训项目名称
细菌菌落总数的测定
学时
6学时
实训目的
1.掌握细菌菌落总数测定的程序
2.学会国标法测定菌落总数的方法和技能
一、定义
菌落总数:食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
二、设备和材料
恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器、1 mL和10 mL无菌吸管或微量移液器及吸头、250 mL无菌锥形瓶、90 mm无菌培养皿、pH计或精密pH试纸。
2．其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3．当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
五、结果与报告
(一)菌落总数的计算方法
4.按3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。
5.根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
A.3无菌生理盐水
A.3.1成分
氯化钠8.5g、蒸馏水1000mL
A.3.2制法
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
（三）菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
1．选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.及时将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
（二）培养
1．待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48 h±2 h。水产品30℃±1℃培养72 h±3 h。
2．如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按1条件进行培养。
6．若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（二）菌落总数的报告
1．菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
2．菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
上述数据修约后，表示为25000或2.5×104。
3．若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4．若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5．若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。