第9章 发酵产物的提取与分离

（1）影响发酵液过滤的因素
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。 • 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• 发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低 滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。 • 改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、 添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。
• 反复冻融法是将细胞反复在低温下突然冷 冻后在室温下融化，最后引起细胞破碎。 • 低温冷冻使细胞膜的疏水键结构断裂，增 加细胞亲水性能；同时胞内水结晶使细胞 内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨 胀而破裂。 • 可采用此法处理细胞壁较脆弱的菌体，但 通常破碎率较低，有时即使反复如此处理 仍不能提高破碎率。 • 此外还可能引起对冻融敏感的蛋白质变性。
• （3）色素及其他物质的去除 • 常用的脱色方法有离子交换剂、离子交换 纤维、活性炭等材料吸附。
2．离心过滤与菌体分离
• 菌体分离通常采用离心分离和过滤两种方 法。 • 离心分离是在离心力场的作用下，将悬浮 液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒 较小的悬浮液和乳浊液的分离。 • 离心方法有差速离心法、密度梯度离心、 等密度离心、平衡等密度离心。 • 细菌和酵母菌发酵液多采用离心分离。 • 霉菌和放线菌多采用过滤分离。
• （1）等电点沉淀法：利用两性电解质在电中 性时溶解度最低的原理进行分离纯化。在低 离子强度下，调节至等电点，可使各种两性 电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解 度。
• 不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。
• 优点是许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范 围内，而许多无机酸价格低廉，并能为食品 标准允许，因此常可无须除掉残余的酸，而 直接进行下一步纯化操作。 • 缺点是酸化时，容易引起蛋白质失活。不少 蛋白质与金属结合后等电点会发生偏移。
• ②非机械法： • 酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁成分 的特殊化学键，达到使细胞破碎的目的。 分为外加酶法和自溶法（常采用加热或干 燥法）。 • 渗透压冲击法是将细胞先放入高渗透压的 介质中，在达到平衡后，介质被突然稀释， 或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速 进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁 的破裂。
• X-press法或Hughes press法是一种改进的高压法，其 操作方法是将浓缩的菌体悬浮液冷冻至-25℃~-30℃形成 冰晶，利用500Mpa以上的高压冲击，将冷冻细胞从高压 阀小孔中挤出。由于冰晶体的磨损，造成包埋在冰晶体中 的微生物变形而引起细胞破碎。
• 此方法适用范围广，破碎率高，细胞碎片 的粉碎程度低，活性保留率高。但是不能 用于对冷冻融解敏感的生物物质。
• （5）盐析法：在蛋白质溶液中加入一定量 的中性盐后，盐离子在水中发生水化，使 蛋白质脱去水化膜层，暴露出疏水区域， 疏水区域相互作用使蛋白质沉淀；同时中 性盐的解离，中和蛋白质所带电荷，使蛋 白质分子间排斥作用减弱而相互聚集。
• 中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，生产上常 用硫酸铵。
• 其优点是成本低、操作简单、安全和对许 多生物活性物质具有稳定作用。
• 干燥法可采用空气于燥、真空干燥、喷雾 干燥和冷冻干燥等。 • 干燥过程能使细胞膜渗透性改变，再用丙 酮、丁醇或缓冲液等处理时，胞内物质就 容易被抽提出来。
• （3）细胞碎片的分离：常用离心分离法。 • 近年来利用双水相萃取法，使生物大分子 或细胞碎片在两相或多相中进行不同的分 配，达到分离的目的。 • 另外，向细胞碎片悬浊液中加入某种固体 吸附剂，或使悬浮液通过装有吸附剂的固 定床，也可达到去除细胞碎片的目的。
• （2）盐酸盐法：在发解液中加入盐酸，使 氨基酸成为氨基 （3）金属盐法：在发酵液中加入重金属盐， 使难溶的氨基酸金属盐沉淀析出。沉淀经溶 解后，调pH值至氨基酸等电点，使氨基酸 沉淀析出。 • 谷氨酸提取
①等电点——锌盐法：谷氨酸与硫酸锌(ZnSO4· 7H2O)，生 成谷氨酸锌盐沉淀。 ②钙盐法提取谷氨酸：
9.2 发酵液的预处理及菌体分离
• 发酵液预处理及菌体分离是下游加工的第 一步操作。 • 目的是改善发酵液的性质，去除部分可溶 性杂质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利 于提取和精制工序的操作。 • 预处理中常用酸化、加热、加絮凝剂、过 滤、离心等方法。
1．发酵液的预处理
• 杂质直接影响产品质量和收得率，对提取 和精制也有很大影响，特别是高价无机离 子和杂蛋白等。 • 高价无机离子会影响树脂对生化物质的交 换容量。 • 杂蛋白降低树脂的交换容量和吸附能力， 溶剂萃取时引起乳化，堵塞过滤介质，或 使滤膜受到污染。
• （6）非离子型多聚物沉淀：可用于选择性 沉淀从而纯化蛋白质，应用最多的是聚乙 二醇(PEG)。 • 作用机制有几种假设：多聚物与有机溶剂 相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大 分子形成复合物，发生共沉淀作用等。 • 优点：操作条件温和，不易引起生物大分 子变性，沉淀效果好，沉淀后的多聚物容 易除去，广泛应用于核酸、蛋白质、细菌 和病毒等的分离纯化。
等 电 点 锌 盐 法
钙 盐 法 提 取 谷 氨 酸 工 艺 流 程
• （4）有机溶剂沉淀法：许多有机溶剂如丙 酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生 物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大 分子发生沉淀作用。 • 这种沉淀作用主要是由于水溶液介电常数 降低、静电引力增大，带电溶质互相吸引 凝集。 • 具有水化层的生物分子，有机溶剂与水的 作用，使得这些分子脱水而相互聚集析出。
2．膜分离技术
• 其实质是物质通过膜的传递速度不同而得 到分离。 • 优点：过程一般较简单，操作方便，费用 较低，效率较高，无相变，可在常温下操 作，既节能又特别适用于热敏性物质的分 离纯化。
（1）膜分离技术分类
• ①透析：是利用膜两侧浓度差，使溶质从 浓度高的一侧，通过膜孔扩散到浓度低的 一侧，从而实现分离的过程。 • ②电渗析：是一种以电位差为推动力，利 用离子交换膜选择性地使阴离子或阳离子 通过的性质，达到从溶液中分离电解质目 的。
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。 • 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。 • 但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处 理和菌体分离、提取、精制、成品加工。
发酵产品后处理过程流程图
• 发酵液预处理和菌体分离是采用凝聚和絮凝 等技术，加速固液分离，提高过滤速度。如 果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分 离细胞碎片。 • 初次纯化即提取，主要是除去与目标产物性 质有很大差异的物质，浓缩产物，提高产品 质量。常用方法有沉淀、吸附、萃取等。 • 高度纯化即精制，采用对产品有高度选样性 的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂 质。典型的方法有层析、离子交换等。 • 成品加工是为了获得质量合格的产品，常用 浓缩、结晶、干燥等技术方法。
• 微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有 些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首 先要收集菌体，进行细胞破碎。 • （1）微生物细胞壁的组成与结构： • ①细菌细胞壁：肽聚糖。 • ②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是 葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。 • ③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几 丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
• （1）高价无机离子的去除：发酵液中主要 的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+等。 • 钙离子常使用草酸去除。 • Mg2+可加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可 溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 • Fe3+用黄血盐(亚铁氰化钾 )反应生成普鲁士 蓝沉淀除去。
（2）杂蛋白的去除：
• ①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀， 或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行 沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进 行沉淀。 • ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。 • ③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。
• 过滤的原理是悬浮液通过过滤介质时，固态 颗粒与溶液分离。 • 根据机理，过滤可分为澄清过滤和滤饼过滤。 • 澄清过滤中，过滤介质为硅藻土、砂、颗粒 活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充 在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以 澄清。 • 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
• 超声波法是利用超声波的空穴作用使细胞 破碎，由于这种空穴泡又受到超声波的迅 速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由此引起的黏滞性旋涡在介 质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使 细胞内液体发生流动，造成细胞破碎。 • 超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，所 以操作时可以在细胞悬浮液中投入冰块或 在夹层中通人冷却水进行冷却。
• ③微滤：微孔过滤，利用孔径 0.025μm~14μm的多孔膜，过滤含有微粒 的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、 分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通 常为0.1MPa~0.5MPa。 • ④超滤：滤膜孔径为1 nm~20 nm，用于过 滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为 推动力，通常为0.1MPa~0.6MPa。
• ①调pH：除去蛋白质等两性物质，改变易 吸附分子的电荷性质，减少滤膜堵塞和污染。 • ②凝聚与絮凝：形成较大絮团，减少堵塞。 • ③吸附剂法：将细菌吸附在吸附剂上，形成 较大的颗粒，减少堵塞。 • ④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞 改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速 度。
3．细胞破碎与分离
第9章 发酵产物的提取与精制
• 发酵液下游加工是指从发酵产物中分离、 纯化产品的过程，是利用产物和杂质的物 理化学性质不同提取产物或者从系统中去 除杂质的操作。
9.1 概述
• 1．发酵液的一般特性
• （1）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。 • （2）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、 其他代谢副产物、残留培养基、无机盐等。 • （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。 • （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶 剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件下易失活或 分解。