实验三 细菌鉴定中的几种生化试验
各种微生物生化试验方法原理
各种微生物生化试验方法原理通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。
1、糖类分解产物（1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。
例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。
这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。
而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。
（2）VP试验（V oges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。
大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。
（3）甲基红试验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。
但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。
故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
（4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。
大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。
2、蛋白质及氨基酸的分解产物（1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。
细菌的生化试验
细菌的生化试验目的要求了解细菌生化试验的原理、方法及在细菌鉴定中的意义。
仪器及材料温箱、接种环、酒精灯、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、醋酸铅蛋白胨水培养基、柠檬酸盐琼脂斜面培养基、MR试剂、VP试剂、靛基质试剂、大肠杆菌、产气杆菌、沙门氏菌的24h纯培养物等。
方法与步骤细菌的生化试验，就是通过用生物化学的方法分析细菌的代谢产物来鉴别细菌的试验。
下面是几种常用的生化试验。
只有纯培养的细菌才能用来做生化试验。
1．糖发酵试验将细菌无菌操作接种于糖发酵培养基中，于37℃培养24～48h，结果：只产酸(＋)，产酸产气(⊕)，不发酵(-)。
2．甲基红(MR)试验与维－培(VP)试验取菌接种于2支含0.5%葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃温箱培养4d，分别作甲基红和维－培试验。
（1）甲基红试验取上述培养基一支，加入甲基红试剂(甲基红0.1g溶于95%酒精300ml中)5～6滴，液体呈红色者为阳性，黄色者为阴性，橙色者为可疑。
（2）维－培试验取上述培养基一支，先加维－培甲液(6%α－甲萘酚酒精溶液)3ml，再加入维－培乙液(40%氢氧化钾水溶液)1ml，混和后静置于试管架内观察2～4h，凡液体呈红色者为阳性，不变色者为阴性。
3．靛基质试验有些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质(吲哚)，遇相应试剂而呈红色。
试验时，取菌接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养2～3d；于培养基中加入戊二醇或二甲苯2～3ml，摇均，静置片刻后，沿试管壁加入靛基质试剂(配法：对二甲基氨基苯甲醛1.0g，95%酒精95ml溶解后，再加浓盐酸50ml)2ml，若能形成玫瑰靛基质而呈红色，则为阳性反应，不变色为阴性反应。
4．HS试验某些细菌能分解培养基中含硫氨基酸如半胱氨酸等产生硫化氢，硫化2氢遇醋酸铅或硫酸亚铁则形成黑色的硫化铅或硫化亚铁。
用接种针取菌穿刺于含有醋酸铅或硫酸亚铁的琼脂培养基中，37℃培养4d，凡沿穿刺线或穿刺线周围呈黑色者为阳性，不变色者为阴性。
细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别
沙门菌） （二）肠杆菌科的鉴别（大肠杆菌&沙门菌） 肠杆菌科的鉴别（大肠杆菌 沙门菌 1、麦康凯琼脂平板 、 中性红） （乳糖、胆盐、指示剂：1%中性红） 乳糖、胆盐、指示剂： 中性红 方法：划线， 方法：划线，分解乳糖 2、三糖铁琼脂斜面 、 （葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示剂： 葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示剂： 0.5%酚红） 酚红） 酚红 方法： 方法：先划斜面再穿刺 菌落变红
三、实验内容
（一）细菌ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生理生化试验
1、细菌对空气（氧气）的需要 、细菌对空气（氧气） 空气 菌种：大肠杆菌、 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基： 培养基：葡萄糖深层琼脂 2、pH对细菌生长的关系 、 对细菌生长的关系 菌种：乳酸菌、大肠杆菌、 菌种：乳酸菌、大肠杆菌、巴氏杆菌 培养基：营养琼脂斜面（ 培养基：营养琼脂斜面（pH6、pH7.5、pH9） 、 、 ） 3、细菌对营养的要求 营养的要求 、细菌对营养 菌种：大肠杆菌、 菌种：大肠杆菌、巴氏杆菌 培养基：斜面（水琼脂、营养琼脂、鲜血琼脂） 培养基：斜面（水琼脂、营养琼脂、鲜血琼脂）
实验三、细菌的生理生化试验 实验三、 及肠杆菌科的鉴别
一、目的要求
• 掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、 掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、 方法、 方法、结果判定以及在诊断中的运用 • 熟悉大肠杆菌和沙门菌主要培养特性和常 规微生物学诊断方法
二、实验材料
• 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 巴氏杆菌、 菌、巴氏杆菌、乳酸菌 • 培养基：葡萄糖高层琼脂、营养琼脂斜面 培养基：葡萄糖高层琼脂、 ）、三类琼脂斜面 （pH6、pH7.5、pH9）、三类琼脂斜面 、 、 ）、 水琼脂、营养琼脂、鲜血琼脂）、氧化-发 ）、氧化 （水琼脂、营养琼脂、鲜血琼脂）、氧化 发 酵培养基、普通平板、麦康凯平板、 酵培养基、普通平板、麦康凯平板、三糖铁 斜面、 斜面、各类生化反应管等 • 器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭 器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、 菌吸管、胶头、灭菌液体石蜡、酒精灯、 菌吸管、胶头、灭菌液体石蜡、酒精灯、废 报纸等
微生物生化鉴定3篇
微生物生化鉴定【微生物生化鉴定】微生物生化鉴定是一种鉴定微生物种类和特性的方法，它通过检测微生物代谢产物和酶的活性等生化特性来对微生物进行鉴定。
在微生物的研究、诊断和治疗等方面都有着广泛的应用。
下面我们将分别介绍鉴定细菌、真菌和病毒的微生物生化鉴定方法。
一、细菌的微生物生化鉴定1. 常规生化试验：包括氧化-发酵试验、铁锰试验、利用光对紫杆菌的鉴别、胶原酶酶切试验等。
2. 抗生素敏感试验：对于致病菌的抗生素敏感试验是非常重要的生化鉴定方法。
在临床上，通过检测微生物对各种抗生素的敏感性来确定选用哪种抗生素进行治疗。
3. 酸碱度试验：对于肠道菌等产生乳酸的菌株，可以通过酸碱度试验来鉴定其种类。
4. 糖代谢试验：细菌不同的糖代谢方式也是一种微生物生化鉴定方法。
二、真菌的微生物生化鉴定1. 吸附凝集实验：可用于白色念珠菌的鉴定。
2. 纸片扩散法：可用于真菌药物敏感性试验。
3. 不同培养基的试验：对于不同种类的真菌，它们对不同培养基有不同的适应性，可以通过这种方法来进行鉴定。
4. 营养需求试验：真菌的营养需求也不同，通过对真菌在培养基上的生长情况进行观察，可以对其种类进行初步鉴定。
三、病毒的微生物生化鉴定1. 免疫荧光试验：通过对病毒进行免疫染色等手段来进行鉴定。
2. 基于PCR技术的鉴定：包括标准PCR、荧光PCR和荧光定量PCR等方法。
3. 细胞培养法：将病毒在细胞培养基上培养，观察病毒在细胞上的生长和变化，以进行鉴定。
总之，微生物生化鉴定方法是一种基础的、重要的微生物鉴定方法，对于微生物的研究、诊断和治疗等方面都具有重要的意义。
不同类型的微生物鉴定方法不同，需要根据具体的情况进行选择和操作。
通过合理地运用微生物生化鉴定方法，可以更准确地鉴定不同类型的微生物，为其应用提供有力的支持。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告一、引言在微生物学中，鉴定细菌的方法有很多种，其中生理生化反应实验是最常用的一种方法之一。
生理生化反应实验可以通过观察细菌对不同物质的代谢情况来确定其种类和特性。
本报告将介绍细菌鉴定中常用的生理生化反应实验。
二、目的本报告旨在介绍常用的生理生化反应实验，包括试剂、操作步骤、结果解释等内容，以帮助读者更好地了解和掌握这些实验。
三、材料与方法1. 大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）培养基；2. 硝酸盐还原试剂；3. 糖类试剂：葡萄糖、果糖、半乳糖；4. 氨基酸试剂：天冬氨酸、赖氨酸；5. 酶试剂：淀粉酶、蛋白酶；6. 无水硫酸铜溶液。
四、实验步骤及结果解释1. 硝酸盐还原试验步骤：（1）取一支细菌液体培养物，加入硝酸盐还原试剂；（2）观察液体颜色变化。
结果解释：若液体变为红色，则表示细菌能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，是亚硝化菌。
若无颜色变化，则表示细菌不能还原硝酸盐。
2. 糖类代谢试验步骤：（1）取三个试管，分别加入葡萄糖、果糖、半乳糖；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释：若在葡萄糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用葡萄糖进行发酵代谢；若在果糖或半乳糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用果糖或半乳糖进行发酵代谢。
3. 氨基酸代谢试验步骤：（1）取两个试管，分别加入天冬氨酸和赖氨酸；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释：若在天冬氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用天冬氨酸进行代谢；若在赖氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用赖氨酸进行代谢。
4. 酶代谢试验步骤：（1）取两个试管，分别加入淀粉和蛋白质；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内颜色变化情况。
结果解释：若在淀粉试管内出现了透明带，则表示该细菌能够分泌淀粉酶；若在蛋白质试管内出现了变色，则表示该细菌能够分泌蛋白酶。
微生物生化鉴定
常用生化试验一．糖、醇发酵试验1、糖、醇发酵试验原理:各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶,所以分解糖、醇的能力个不相同。
有的能分解某些糖、醇类,有的则不能分解。
有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气,有的仅产酸,而不产气。
根据这些特点,可鉴别细菌。
培养基:糖发酵试验应用的培养基种类很多,大致可分为液体,半固体,固体(高层、斜面)等几类。
可根据试验的要求与细菌的特性来选择。
2.乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)原理:某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产生丙酮酸,并将丙酮酸脱羧,变为乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境下,被空气中的氧氧化成二乙酰,二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生成红色的化合物。
故在培养基中加入少量含胍基的化合物,如肌酸、肌酐可增加胍基含量。
试验中加入的α-萘酚为催化剂,可加速此反应,使反应颜色增加,提高反应的敏感性。
大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧,故V-P试验呈阴性。
培养基:磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基3.甲基红试验(MR试验)原理:许多细菌如大肠埃希菌等,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸再次被分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,这样使培养基的PH降至4、5以下。
这时加入甲基红指示剂呈红色。
若细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其她物质(如醇、酮、醛、气体与水等),则培养基的酸度仍在PH6、2以上,故加入甲基红指示剂呈黄色,为阴性反应。
培养基:磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基MUG葡萄糖醛酸苷酶试验原理:细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下,作用于4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸甘(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide简称MUG)的β葡萄糖醛酸甘键,使其水解,释放的4-甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
培养基:MUG培养基4.β-半乳糖苷酶试验原理:肠杆菌科细菌发酵乳糖,依靠半乳糖苷渗透酶与β-半乳糖苷酶两种不同的酶作用,能水解邻硝酸酚-β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG),而释放出黄色的邻硝酸酚。
微生物鉴定中常用的生理生化试验
微生物鉴定中常用的生理生化试验一、实验目的1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种四种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料1.菌种大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。
实验三细菌的生化鉴定
一、糖（苷、醇）利用试验：
乳糖分解利用试验
• 【原理】
不同旳细菌对不同旳糖（苷、醇）旳分解 能力不同，有旳分解，有旳不能分解，有 旳分解后能产酸产气，有旳分解后仅能产 酸，所以能够用来鉴别细菌。
以乳糖分解利用为例，乳糖发酵管中含溴 甲酚紫指示剂，当细菌分解乳糖产酸，培 养基pH下降，指示剂变黄色，不分解乳糖 旳指示剂不变色。
纸片中心，滴加一滴1%四甲基对苯二胺。 • 4．立即观察菌落颜色旳变化。 • 5．同法做铜绿假单胞菌旳氧化酶试验。
氧化酶试验
• 【成果】 滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立 即变为紫色，为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色， 为氧化酶阴性。
氧化酶试验（左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌）
氧化酶试验
• 【注意事项】 • 1．试验中旳菌种要求新培养旳，不宜用陈旧旳培养物。 • 2．刮取细菌时不可遇到培养基，不可用接种环等金属物
尿酶试验（U）
• 【试剂与器材】 • 1、菌种 大肠埃希菌、一般变形杆菌 • 2、器材 尿素培养基、接种针或接种环、
酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37℃恒 温培养箱，超净工作台。
尿酶试验（U）
• 【操作环节】 • 1、取2支尿素培养基，用记号笔分别标识
大肠埃希菌和一般变形杆菌。 • 2、按液体接种法，将2菌分别接种于尿素
1g，95%乙醇95ml，浓盐酸20ml配制） • 3．器材 蛋白胨水培养基、接种针或接种
环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、 37℃恒温培养箱，超净工作台。
吲哚试验
• 【操作环节】 • 1．取2支蛋白胨水培养基，用记号笔分别
标识大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。 • 2．按液体接种法，将2菌分别接种于蛋白
过பைடு நூலகம்化氢酶试验
细菌鉴定中常用的生理生化反应
菌于以上平板的各相应部位。 3. 培养：倒置于37℃培养48 h后观察结果。
淀粉水解试验示意图
淀粉水解后遇碘不再显蓝色。 培养：置28℃培养48～120 h后观察结果。 淀粉水解后遇碘不再显蓝色。 掌握细菌生化反应试验的基本方法。
（二）明胶液化试验 明胶液化试验结果观察 观察试管明胶培养基是否液化及液化的形态。
枯草杆菌。 器材 : 试管、小套管、培养皿、接种环、酒精灯、恒温培养箱
淀粉水解试验 某些细菌能产生淀粉酶将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再吸收利用。
2. 接种：以无菌操作分别穿剌接种大肠杆菌、枯草杆 标记 ：取淀粉培养基平板1块，在其左右两边分加标记大肠杆菌、枯草杆菌。
coli）、变形杆菌、枯草杆菌 了解几种细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。
菌至以上各相应试管中。 明胶液化试验 某些细菌能分泌明胶酶分解明胶产生小分子物质，使培养基由凝固状态变成液态。
掌握细菌生化反应试验的基本方法。 了解几种细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。
3. 培养：置28℃培养48～120 h后观察结果。 培养基灭菌时要尽量排尽锅内冷空气，灭菌后要等锅内压力降到零再打开排气阀。
细菌生化反应实验报告
一、实验目的1. 了解细菌生理生化反应的基本原理。
2. 掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。
3. 熟悉生理生化反应在细菌鉴别中的实际应用。
二、实验原理细菌生理生化反应是指细菌在生长代谢过程中，通过酶催化作用，将底物转化为产物的化学反应。
这些反应能够反映细菌的代谢类型和生理特性，从而用于细菌的鉴定。
常见的细菌生理生化反应包括吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、糖发酵试验等。
三、实验材料与仪器1. 菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。
2. 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂。
3. 仪器：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管。
四、实验步骤1. 接种：将菌种接种于相应的培养基中，37℃恒温培养箱中培养24小时。
2. 吲哚试验：取少量培养液，加入吲哚试剂，观察颜色变化。
3. 甲基红试验：取少量培养液，加入甲基红试剂，观察颜色变化。
4. V-P试验：取少量培养液，加入V-P试剂，观察颜色变化。
5. 糖发酵试验：将不同糖类培养基分别接种菌种，观察颜色变化。
五、实验结果与分析1. 吲哚试验：大肠杆菌和产气肠杆菌呈现阳性反应，普通变形菌和枯草芽孢杆菌呈现阴性反应。
2. 甲基红试验：大肠杆菌和产气肠杆菌呈现阳性反应，普通变形菌和枯草芽孢杆菌呈现阴性反应。
3. V-P试验：大肠杆菌和产气肠杆菌呈现阳性反应，普通变形菌和枯草芽孢杆菌呈现阴性反应。
4. 糖发酵试验：大肠杆菌和产气肠杆菌对葡萄糖、乳糖和蔗糖均呈现阳性反应，普通变形菌和枯草芽孢杆菌对葡萄糖和乳糖呈现阴性反应。
六、实验结论通过本次实验，我们掌握了细菌生理生化反应的基本原理和实验方法。
通过对吲哚试验、甲基红试验、V-P试验和糖发酵试验的结果分析，我们可以初步判断出大肠杆菌和产气肠杆菌为阳性反应，普通变形菌和枯草芽孢杆菌为阴性反应。
这表明生理生化反应在细菌鉴别中具有重要的实际应用价值。
细菌鉴定用生理生化试验2015
细菌生理生化鉴定技术讲义实验一糖（醇、苷）类发酵试验(安排至少六种糖的发酵实验，包括单糖、双糖、三糖、醇类和非糖类各一种)（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管（杜氏管），或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，使培养基中的指示剂发生变色反应，产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
溴百里香酚蓝的变色范围为pH6.7(黄)~7.5(蓝)，通过指示剂颜色变化可以判断是否产酸，从杜氏管中是否又气泡可以判断利用各种糖时是否产气。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，细菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，可借以鉴别细菌，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
一般非致病菌能发酵多种糖，产生多种有机酸和各种气体如CO2、、H2和CH4。
如大肠杆菌能分解葡萄糖有乳糖，产生甲酸等产物，并有甲酸解氢酶，可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气，以“⊕”表示。
微生物鉴定常用的生理生化试验实验报告
山东大学实验报告2017年12月4 日___________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康一、目的要求1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、基本原理1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。
胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。
这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。
2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。
有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。
例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。
当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。
气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。
细菌的常用生化试验
2.氧化-发酵试验（0/F试验）
原理： 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因 是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发 酵。 方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加 无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lcm。将培养基于 35℃培养48h或更长。 结果：
结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
应用：肠杆菌科中属间及种的鉴 别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸
杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌
属中有些菌种也呈阳性，其他菌 属均为阴性。
四、酶类试验
1.氧化酶试验 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系 统的最终呼吸酶。
1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力 各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅 产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中， 置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。 结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸 性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体 培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他 变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的 试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤 为重要。
菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴
性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。
4.尿素分解试验
原理 方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养l8～24h 观察结果。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变 为阴性。
实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验
菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验一、实验目的：1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法二、实验材料：猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mlThornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯；灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个三、试验方法：果聚糖试验（Levan formation）：用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。
在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。
在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。
氧化酶试验（oxidase reaction）：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。
用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。
在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）：在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。
细菌鉴定中常用的生化反应实验
• 柠檬酸盐利用试验 (Cirate test）
细菌鉴定中常用的生化反应实验
实验步骤
甲基红(Methyl red)试验(简称MR试验)
• 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙 酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基 的pH降低到4.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。 因甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)～pH6.2(黄色)。 若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但 很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基的pH仍 在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。
– 出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。
细菌鉴定中常用的生化反应实验
Indole Test
细菌鉴定中常用的生化反应实验
细菌鉴定中常用的生化反应实验
实验原理－－大分子物质代谢实验
• 淀粉水解试验 • 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产
生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊 精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被 细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过 底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝 色。
菌种鉴定中常用的生理生化反应
细菌鉴定中常用的生化反应实验
实验目的和内容
• 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定 中常用的生理生化反应的测定方法；
• 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分 解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多 样性；
• 了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及 其代谢产物在鉴别细菌中的意义；
细菌鉴定中常用的生化反应实验
细菌鉴定中常用的生化反应实验
实验结果
糖发酵实验 Carbohydrate fermentation
细菌鉴定中常用的生化反应实验
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
玫瑰吲哚 （阳性反应）
2、V-P试验 [原理]
葡萄糖
丙酮酸
缩合
乙酰乳酸
脱羧
乙酰甲基甲醇
碱性条件
二乙酰
与培养基中精氨酸 的胍基结合
红色化合物（阳性反应）
3、MR试验
[原理]
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
pH值降至4.5以下
非酸性末端产物(醇、醛等）
pH值＞6.2 甲基红指示剂 培养基橘黄色(阴性反应)
荡，再放入 37℃温箱中保温 15-30min。若培养物呈
红色者，为VP 试验反应阳性 3、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
MR试验
1、将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲 基红试剂 2 滴，培养基变为红色者为阳性，变黄 色者为阴性。 2、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
细菌生化实验误差原因？
柠檬酸盐 利用试验 吲哚试验 硫化氢试验
IMViC 试验
硝酸还原酶试验， 淀粉水解试验
内容
一、糖发酵试验 二、IMViC试验
1、吲哚试验
2、V-P试验 3、MR试验 三、淀粉水解试验
说明
1、本次细菌的生化试验仅选择5项代表性试验
2、本次实验均按传统的生化试验方法进行检测
现代快速生化检测
现代快速生化检测
实验三
细菌鉴定中常用的几种生化试验
细菌的生化试验
用生化的方法来检测细菌对各种基质 的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌 种类，这种生化试验称为细菌的生化反 应试验；是鉴别细菌的重要依据 。
碳水化合物 代谢试验
糖发酵试验 甲基红试验（MR） V-P试验
常 见 的 生 化 反 应
碳源和氮源 利用试验
蛋白质和氨基 酸代谢试验 各种酶类试验
大盒生化鉴定管
快速检测试纸
全自动微生物鉴定系统 使用生化鉴定试剂盒对革兰氏阴性菌和革兰氏阳 性菌进行细菌鉴定。
VITEK®全自动 化微生物鉴定 系统
[目的要求]
1、掌握细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴 定中常用的生理生化反应的测定方法； 2. 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的 分解利用情况，了解细菌代谢类型的多样性； 3、了解细菌在不同培养基中的不同生长现象 及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。
是一组试验； IMViC是靛基质试验或称吲哚试验（I）、 甲基红试验（M）、V-P试验（V）和柠檬
酸盐利用试验（C）的缩写，i是为了发
音的需要加上的；
常用于革兰氏阴性的肠道细菌检测中，
可用于区分产气杆菌属和大肠杆菌属。
1、吲哚（靛基质）试验 [原理] 色氨酸几乎存在所有蛋白质中，某些
细菌如大肠杆菌等具有色氨酸酶。 蛋白胨中的色氨酸 色氨酸酶 靛基质（无色吲哚）
荡，静置分层后，沿管壁缓缓加入5-10滴吲哚试剂，
若上层乙醚层呈玫瑰红色者，为吲哚试验反应阳
性。 3、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
V-P试验
1、确定有无细菌生长？并用空试管将葡萄糖蛋白胨水
培养液分为2半；
2、将其中1半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入5-10滴
40%KOH，然后加入等量的 5%α-萘酚溶液，用力振
现代快速生化检测采用的方式： 简化试剂配制 简化操作过程 底物，指示剂、抑制剂的改良 操作、检测的高度自动化
现代快速生化检测
1、显色培养基
2、生化鉴定管 3、快速检测试纸 4、自动化微生物鉴定系统
显色培养基
海博金黄色葡萄 球菌显色培养基
环凯沙门氏菌显色 培养基
生化鉴定管
柠檬酸盐生化鉴定管
木糖生化鉴定管
3、 观察记录（直接观察记录或加入试剂反应后 再观察记录）
糖发酵试验（直接观察记录）
①确定有无细菌生长？
②确定各菌对糖的分解利用情况： 不利用：用 “－” 表示 产酸： 用 “+” 表示 产酸产气：用 ⊕ 表示
吲哚（靛基质）试验
1、确定有无细菌生长？
2、向蛋白胨水培养液内加入乙醚1-2mL，用力振
甲基红指示剂 培养基变红(阳性反应)
三、淀粉水解试验 [原理]
淀粉酶
检测细菌是否可以产生分泌到胞外的淀粉酶。 淀粉 糊精，双糖和单糖等
碘液 不出现蓝色反应， 菌落周围呈现透 明圈
蓝色
[实验材料]
培养基：葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基， 葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养 基，固体淀粉培养基。
菌种：大肠杆菌，枯草杆菌，普通变形菌，产气 肠杆菌 试剂：卢戈氏碘液，甲基红指示剂，40%KOH， 5%α-萘酚，吲哚试剂，1.6%溴甲酚紫 仪器：略
[注意事项]
1）纯培养物方可进行生化试验
2）严格无菌操作，防止污染情况的发生。
3）减少试剂因素、其它人为因素的误差
4）标记必须准确
[问题和思考]
1、讨论 IMViC 试验在微生物学检验上的意义 2、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 3、不利用碘液你怎样证明淀粉水解的存在？
[方法和步骤]
1、 试管（平板）标记
葡萄糖发酵管 乳糖发酵管 吲哚试验管 V-P试验管 淀粉水解试验平板：4个
用记号笔或者标签纸 在平板底部划成或者 区分为 2 部分
各 9支
2、接种培养
试管接种：以无菌操作分别接种少量待测菌到以上 相应试管中，每菌接2支管,留1管作空白对照不接种， 置37℃恒温箱中培养24～48h。 葡萄糖和乳糖微量发酵管接种:采用接种针 平板接种：以无菌操作分别接种少量待测菌到以上 相应平板中,每平板接2种菌,将平板倒置在 37℃温箱 中培养 24h.
[实验原理] 一、糖发酵试验
根据细菌分解利用糖能力的差异表现 出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。
各种糖
细菌
有机酸（乳酸、醋酸、丙酸等） 气体 （氢气，二氧化碳等）
产酸： 指示剂 （溴甲酚紫）， 由紫色（pH6.8以上)变为黄色 （pH5.4以下) 产气 倒置的德汉氏小管