高级生物化学复习题及答案汇总

PART1核酸化学及研究方法名词解释：1.正向遗传学：通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状的改变。

然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到相应的突变基因，并揭示其功能。

2.核小体组蛋白修饰：核小体组蛋白八聚体中每个组蛋白多肽链的N末端游离在核心之外，常被一些化学基团修饰。

包括①乙酰化：赖氨酸的乙酰化②甲基化：赖氨酸和精氨酸的甲基化③磷酸化：丝氨酸的磷酸化④泛素化：赖氨酸的泛素化3.位点特异性重组：是遗传重组的一类，这类重组依赖于小范围同原序列的联会。

重组也发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化。

4.转座机制：转座是一个DNA片段从基因组中的一个位置转移到另外一个位置的过程，该DNA片段称转座元件或转座子。

①细菌转座子通过“剪切-黏贴”机制进行转录②转座酶两个不同亚基结合在转座子的特定序列上③两个亚基靠在一起形成有活性的二聚体，导致转座子的切除④转座酶-转座子复合物结合到靶DNA上，通过转座酶的催化将转座子整合到新位点上。

5.基因敲除：利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，外源DNA 与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。

此法可产生精确的基因突变，从而达到基因敲除的目的。

6.Sanger双脱氧终止法：主要用于DNA基因分析，是现在应用最多的核酸测序技术（也即第一代DNA测序技术）。

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分四个泳道进行电泳。

以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

7.荧光实时PCR技术原理：是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA 序列进行定量分析的方法。

该技术在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

8.双分子荧光互补(BiFC)技术原理：一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。

该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复，则表明两目标蛋白发生了相互作用。

同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较。

问答题：1.怎样将一个基因克隆到pET32a载体上；原核表达后，怎样纯化该蛋白？利用序列特异性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）切割目标DNA和pET32a载体；DNA 连接酶连接目标DNA和pET32a载体；将重组DNA转化到宿主中；选择或鉴定含有重组DNA的宿主细胞。

原核表达后，纯化蛋白：pET32a表达的是6个HIS标签的蛋白，，可以特异结合二价的镍，可以通过亲和层析的方法纯化该蛋白。

首先将包含重组蛋白的原核表达的产物加到镍的层析柱中，含有HIS 标签的重组蛋白被吸附到柱子上，其他蛋白流出，然后通过加入组氨酸将吸附到柱子上的重组蛋白洗脱下来。

2.通过哪几种方法可以获得cDNA的全长？简述其原理。

（1）cDNA末端快速扩增技术基本思路：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物进行RTPCR扩增，得到该基因的部分cDNA序列，再利用RACE获得cDNA全长。

①RT-PCR②cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得cDNA全长。

RACE具体原理是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3‘端和5’端的方法。

3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物(3amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT1-adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

5’RACE的原理5’RACE与3’RACE略有不同。

首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录mRNA 获得第一链(-)cDNA后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,接下来与3’RACE过程相同。

用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进行PCR扩增全长cDNA的获得通过RACE方法获得的双链cDNA可用限制性内切酶酶切和southem印迹分析并克隆。

通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。

由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。

还可以用在基因特异性引物的5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。

最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE产物中获得全长cDNA。

或者通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。

（2）采用SMART技术，构建全长cDNA的文库。

在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART 引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。

3.什么是DNA探针、种类及标记的方法有哪些？①探针（probe）：指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的，已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链探针种类：ⅰ基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

ⅱcDNA探针以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。

ⅲRNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。

具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。

ⅳ寡核苷酸探针Ⅱ标记物（略看）ⅰ放射性同位素标记物：核酸标记中，32P和35S使用频率高。

32P标记核苷酸的α位或γ位，35S则是标记核苷酸的α位.优缺点：射线对人体有伤害，放射性物质需特殊的处理，半衰期短不宜存放使用ⅱ非放射同位素标记物：常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素优缺点：分辨率不如同位素标记，检测时间短，操作简便，不需特殊的防护设备，不存在放射性污染探针标记方法：（1）随机引物法（random priming）利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。

将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新DNA链。

（2）切口平移法胰DNA酶Ⅰ在DNA双链上随机切开若干切口，切口处形成3’-OH末端。

大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ从切口处开始作用，以另一条DNA链为模板。

4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。

生成的两条链都被同位素均匀标记。

（3）末端标记法5’端标记法T4噬菌体多苷酸激酶(T4polynucleotide kinase)a.用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，b.然后在（γ-35S）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将γ位上的35S转移到DNA或RNA分子的5’OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带35S标记。

3’端标记法利用末端转移酶(Terminal transferase,TdT)：催化单链或双链DNA的3’末端-OH掺入核苷酸标记分为两步：1)TdT在DNA的3‘末端掺入SH-GTP2)–SH不稳定，用Maleimide(顺丁烯二酰亚胺)进行偶联反应。

（4）PCR方法PCR标记法是在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记成dNTP的一种方法，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。

4.哪些方法可以检测转录水平(mRNA水平)的表达差异？简述原理。

根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为：封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。

开放性系统研究方法:如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。

⑴Northern印迹杂交应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA 分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。

⑵反转录PCR（RT-PCR）可用于mRNA的半定量分析是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。

RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。

该方法适合对待测样品进行初步筛选。

⑶实时定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。