叶绿素含量的测定53192

叶绿素含量的测定（分光光度法）一、直接浸取法

1.将新鲜的小麦叶片剪成0.2cm 左右的细丝或小块混合均匀后，称取0.1—0.2g，放入25ml 的容量瓶或具塞试管中。

2.在容量瓶或试管中加入 0.5ml 纯丙酮和 10—15ml 80%的丙酮，并仔细将粘附在瓶壁边缘的叶子碎末洗到丙酮溶液中，盖上瓶塞，室温下置暗处浸提过夜，其间摇动3—4 次

3.次日取出容量瓶，观察叶组织已全部变白时，表示叶绿素已浸提干净，然后用 80%丙酮定容至 25ml，过滤或离心后，波长 645nm，663nm，652nm 比色

二、研磨法

根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度 A 值与其中溶质浓度C 以及光径L 成正比，即A＝aCL（a 为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b 含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b 含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

645nm，又知在波长663nm 下，叶绿素a、b 在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm 下分别为16.75 和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：

A663=82.04Ca +9.27Cb

A652=34.5×CT

由于652nm 为叶绿素 a 与 b 在红光区吸收光谱曲线的交叉点（等吸收

两者有相点），同的比吸收系数（均为34.5 ），因此也可以在此波长下测定一次吸光

度（A652）求出叶绿素总量：

CT（g/L）=A652/34.5

CT（mg/L）=A652×1000/34.5………（ 8）因此，可利用（5）、（6）式可分别计算叶绿素a 与 b 含量，利用（7）式或（8）式可计算叶绿素总量。

一、仪器、药品与材料

（一）实验材料不同生境的新鲜植物叶片。

（二）仪器与用品分光光度计，天平（感量0.01g ），研钵，漏斗，量筒，滤纸等。（三）试剂

１．丙酮。

2 ．80 ％丙酮：取80 mL 纯丙酮加入20 mL 蒸馏水混匀即得。

3 ．石英砂。

4．无水CaCO3。

二、实验步骤1．叶绿体色素溶液提取：选取不同生境下生长植物的成熟叶片用80%丙酮进行提取。

（1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

（2）称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3 份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml80％丙酮，研成均浆，再加丙酮10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

（3）取滤纸 1 张，置漏斗中，用丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml 棕色容量瓶中，用少量丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

（4）用滴管吸取丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用丙酮定容至25ml，摇匀。

（5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm 的比色杯内。

2．测定吸光度值：以80%丙酮作为参比溶液，分别在652nm、663nm 和645nm 处测定叶绿体色素提取液（浓度大时需稀释）的光吸收值。

3 ．计算：把测得的光吸收值代入上述5 、6 、7 和8 等公式计算出叶绿素a 、b 和叶绿素总量。在计算时需要考虑稀释因子。