亚细胞蛋白质组学

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一、亚细胞蛋白质组学的内涵
大分子结构体 (macromolecular structure)或多 蛋白质复合体 (multiprotein complex)
如核基质 (nuclear matrix)、剪接体 (spliceosome )、纺锤体 (spindle pole)、核孔结构 (nuclear pore complex)以及核糖体 (ribosome)等。
4类亚细胞定位
12种亚细胞定位
SignalP、ChloropP和 MTP识别三者相结合
氨基酸组成与分拣 信号识别相结合
注：CTP 叶绿体运输肽 (chloroplast transit peptide) ; NLS 核定位信号 (nuclear localization signals); MTP 线粒体引导肽 (mitochondrial targeting peptide); SP 信号肽 (signal peptide)。 28
亚细胞成分
细胞核 核膜* 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 粗面内质网小泡 光面内质网小泡 胞膜 大片 小泡 核内体 高尔基体(完整) 高尔基体(小泡) 肌质网 叶绿体 植物线粒体
大小/μm
4~12 0.4~2.5 0.4~0.8 0.4~0.8 0.05~0.35 0.05~0.3 3~20 0.05~2.0 0.05~0.4 1.0~2.0 0.05~0.5 0.1~1.0 2~5 1~3
亚细胞成分
细胞核
密度/（g· cm-3）
蔗糖
>1.30
低渗透压介质*
1.21~1.24
核膜
线粒体 Mitoplast 线粒体质 溶酶体
1.18~1.22
1.17~1.21 1.44 1.19~1.21
n.a.
1.15~1.20 n.a. 1.10~1.15
过氧化物酶体
粗面内质网 光面内质网 细胞膜 大片 小片 核内体
时间/min
5~10 30 (5) 10~15 10~20 10~20 30~60 30~60 10~15 30~60 30~60 20~30 20~40 20 10 15
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* 核膜的制备物是否是完整的包膜，它的沉降速率取决于制备的方式。
密度梯度离心 (isodensity centrifugation)
又称为区带离心，是将样品溶液臵于一个由梯度材 料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区 带层分布于梯度柱中。按照离心分离原理，梯度离心 又可分为速率区带离心法 (又称连续密度梯度离心法)和 等密度离心法 (又称不连续密度梯度离心法)。
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速率区带离心法是根据样品中不同组分粒子
所具有的不同体积尺寸大小和不同沉降系数进行分离。
内容物
细胞核，重线粒体，大片细胞膜 重线粒体，细胞膜碎片
线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，完整高尔 基体
线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体 溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体膜，大的 高密度小泡（如粗面内质网） 从内质网而来的所有小泡，细胞膜，高尔基 体，核内体等
注：RCF即相对离心力。
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细胞器的大小和沉降特性
(Signaling complex )
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基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
Y X
agarose
G
agarose
G
agarose
G
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实验设计思路
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酶
通用 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 高尔基体 内质网 核膜
线粒体外膜
线粒体内膜
单胺氧化酶
细胞色素氧化酶
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（二）蛋白质组学技术
蛋白质分离技术与蛋白质 鉴定技术的结合
传统2D-MS
1D或LC + MS
2D-LC-MS/MS
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（三）蛋白质亚细胞定位实验技术
为了验证亚细胞蛋白质组学的研究结果，如新发现蛋白质 的亚细胞定位及其在亚细胞结构中的可能功能，需要细胞或分 子生物学的补充实验予以证实。
线粒体和叶绿体 蛋白质
膜蛋白质 膜蛋白质 12种亚细胞定位 5种亚细胞定位
识别MTP和CTP
识别跨膜螺旋和拓扑 结构 识别跨膜螺旋和拓扑 结构 氨基酸组成分析 氨基酸组成分析
TargetP
PSORT
http://www.cbs.dtu.dk/services/TaregtP/
http://psort.nibb.ac.jp/
力研磨或剪切
2、亚细胞组分的分步分离
差速离心 与密度梯度离心 联用
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差速离心 (differential centrifugation)
是利用样品中各种组分的沉降系数不同而进行分 离的方法，又称差分离心或差级离心。通常两个组分 的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。
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优点：样品处理量较大，可用于大量样品的初
级分离。
缺点：分离复杂样品和要求分离纯度要求较高
时，离心次数太多，操作繁杂。
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例
差速离心形成的沉淀（肝脏）
沉淀
P1 P2 P3 P4 P5 P6
RCF (gav)×时间
1 000g×10min 3 000g×10min 6 000g×10min 10 000g×10min 20 000g×10min 100 000g×10min
亚细胞蛋白质组学
基础医学院 病理生理学教研室
刘 芸
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授课提纲
第一节
第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
概论
细胞膜的蛋白质组学研究进展 高尔基体蛋白质组学研究进展 核孔复合体蛋白质组学研究进展 核仁蛋白质组学研究进展 线粒体蛋白质组学研究进展 展望
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第一节 概论
真核生物体是一个复杂系统。
蛋白质在胞浆合成后，须在N端分拣信号 (sorting signal) 的 指引下到达不同亚细胞部位发挥生物学功能。常用于蛋白质亚细 胞预测的各种分拣信号包括：信号肽 (signal peptide, SP)、线粒
体引导肽 (mitochondrial targeting peptide, MTP)、叶绿体运
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一、亚细胞蛋白质组学的内涵
细胞器(organelle)或细胞区域
如细胞膜 (cell membrane)、细胞浆 (cytoplasm )、线粒体 (mitochondria )、溶酶体 (lysosome)、过氧化物酶体 (peroxisome)、 内质网 (endoplasmic reticulum)、高尔基体 (golgiosome)和细胞核 (cell nucleus)等。
等密度区带离心法是根据样品组分的密度差别
进行分离纯化。
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密度梯度离心介质
蔗糖梯度
便宜，溶解度高，能够制备分离绝大多数成分所要求的密度范围的溶液， 最常用；
高浓度时黏性大，且渗透压高。
Ficoll Percoll Nycodenz Metrizoate
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亚细胞成分在蔗糖和低渗透压介质中的密度
线粒体蛋白质
分泌蛋白 核蛋白质
识别MTP
识别SP 识别NLS
Predotar
TMHMM HMMTOP SobLoc NNPSL
http://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-2.0 http://www.enzim.hu/hmmtop/ http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc http://predic.sanger.ac.uk/nnpsl
以人为例，基因组分析表明，人具有3万~5万个基因，经过剪 切和翻译后修饰产生更多的蛋白质种类；受蛋白质等电点极限、 疏水性、相对分子质量范围以及蛋白质丰度限制，很难由2-DE技 术一步到位地获得生物体的全蛋白质组。
蛋白质的亚细胞定位对蛋白质生物功能的发挥起到 极关键的作用，蛋白质亚细胞定位信息强烈暗示着其 生物学功能。
预测功能
叶绿体蛋白质
预测依据
识别CTP
MitoProt
SignalP predictNLS
http://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj /medgen/mitofilter
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP http://maple.bioc.columbia.edu/predicNLS/
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二、亚细胞蛋白质组学的意义
1. 富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组
2. 提供蛋白质的亚细胞定位信息 3. 加深对亚细胞组分的结构功能理解 4. 加深对细胞生理分子机制的理解
5. 利于亚细胞蛋白质组的差异表达谱研究
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三、亚细胞蛋白质组学的技术基础
亚细胞组分的分离纯化 （一）亚细胞组分的分离
蛋白质组学技术研究
RCF/g
500~1 000 2 000 (30 000) 1 000~10 000 6 000~15 000 6 000~15 000 30 000~100 000 50 000~100 000 1 000~3 000 50 000~100 000 50 000~100 000 10 000~20 000 50 000~100 000 10 000~35 000 1 000~2 000 5 000~20 000
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哺乳动物细胞膜的主要酶分布特点
膜成分
细胞膜
顶端膜 基ห้องสมุดไป่ตู้膜 5’-核苷酸酶、亮氨酸氨肽酶、碱性磷酸酶 Na+/K+-ATP酶、激素控制的腺苷酸环化酶 5’-核苷酸酶、 Na+/K+-ATP酶 琥珀酸脱氢酶 Β-半乳糖苷酶、酸性磷酸化酶、芳基硫酸酯酶 过氧化氢酶、尿酸酶 半乳糖苷转移酶 NADPH (或NADH-)细胞色素c还原酶 核苷酸三磷酸酶
1.18~1.23
1.18~1.26 1.06~1.15 1.14~1.19 1.07~1.16 1.06~1.16
1.19~1.22
n.a. 1.03~1.07 1.12~1.15 1.05~1.12 1.05~1.10
高尔基体（完整）
高尔基体（小泡） 肌质网 叶绿体 植物线粒体
1.05~1.12
（一）亚细胞组分的分离
4、亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分
根据细胞或亚细胞组 分中不同种类的翻译后修 饰特性可望用来分离各类 被修饰的蛋白质。
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（一）亚细胞组分的分离
5、分离纯化效果的评价
判断亚细胞分离纯化是否成功，可以用光学或电子
显微镜监测，或者检测蛋白质浓度或合适的标志酶。
纯化过程中跟踪合适的标志酶的活性可以确定目的细胞器 的产率和污染其他细胞器成分的程度。 通过在纯化过程中确定蛋白质的浓度，计算每一步的比活性 （活性与蛋白质的比率），可以用来估算富集程度或纯化倍 数。
Western blot TAP (tandem
affinity purification)
电镜技术 荧光显微镜技术
endoG-YFP
(apoptotic endonuclease)
Mitochondria Co-localization
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（四）蛋白质亚细胞定位预测技术
亚细胞定位预测主要基于蛋白质氨基酸序列的三个 方面的特性：氨基酸组成特点、分拣信号的识别以及氨 基酸序列的进化保守性。
1.05~1.12 1.04~1.08 1.18~120 1.16~1.19
1.03~1.08
1.03~1.08 n.a. 1.10~1.13 n.a. 18
注：n.a. 为未得到数据； * 这些数据是在Nycodenz、 Metrizoate或Percoll中的密度。
（一）亚细胞组分的分离
3、免疫共沉淀法 (Co-IP) 分离信号复合体
亚细胞蛋白组学已日益成为蛋白质组学研究的 焦点之一。
—— Rabilloud T, Kieffer S, Procaccio V et al. Electrophoresis, 1998, 19: 1006-14. 3
一、亚细胞蛋白质组学的内涵
亚细胞蛋白质组学(subcellular proteomics)：针对细胞内不同区域结构功能单位 的蛋白质组学研究。
（二）蛋白质组学技术 （三）蛋白质亚细胞定位实验技术 （四）蛋白质亚细胞定位预测技术
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（一）亚细胞组分的分离
细胞的破碎
亚细胞组分的分步分离
亚细胞 分级
免疫共沉淀分离信号复 合体
亲和层析法分离不同亲和 特性的亚细胞组分
分离纯化效果评价
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（一）亚细胞组分的分离
1、细胞的破碎：渗透压冲击、超声波震荡、机械
输肽 (chloroplast transit peptide, CTP) 和核定位信号 (nuclear
localization signals, NLS)。
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互联网上常用的亚细胞定位预测软件
软件名称
ChloropP
网址 (URL)
http://www.cbs.dtu.dk/services/Chlorop/