亚细胞蛋白质组学
蛋白质组学
两性电解质(Carrier ampholytes)
蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：PMSF等
防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。
9、蛋白质的分级提取（用蛋白质组学方法得到蛋白质）
根据溶解性差异：最大优点？
1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质
14、蛋白质染色方法
胶内：考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)：所需时间较长；灵敏度不高
银染：灵敏度高；对下一步的酶切肽谱提取存在困难
CBB G-250、负染
荧光染料染色：差异蛋白质组学研究，灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。
以及放射性同位素标记等
转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)
大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性
去污剂(Detergents):SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等
破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出
还原剂(Reducing Agents)：β-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等
（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。
（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法
（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。
蛋白质组学
1、蛋白质组（proteome）
蛋白质组学
研究意义背景
研究意义
研究背景
蛋白质组学书籍随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生 命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因 组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯 片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的， 其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA蛋白质，存在三个层次 的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水 平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表 蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相 关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则 几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构 和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修 饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多 样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生 命过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1)生命现象的发生 往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2)多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联 因果。(3)在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。
蛋白质组学
蛋白质组学阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。
包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。
百科名片蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白质（protein）与基因组学（genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1995年提出的。
前言蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。
通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。
确实，那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。
因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。
蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。
基本策略蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.研究基础90年代初期开始实施的人类基因组计划，在经过各国科学家近10年的努力下，已经取得了巨大的成就。
植物叶绿体蛋白质组学研究进展
行 综 述 ．以 全 面 认识 叶绿 体蛋 白 的组 成 、特 点 及 其 在 叶绿 体 代 谢 网 络 中的 作 用 。
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｓ ｂ ｅｌ ｌ ｒ ｐ ｏｅ ｍｉｓ ｓ ｏｓ ｏ ｉ ｈ ｓ ｄ ｆ ｐ ｏｅ ｍｉｓ ｉ ｅ ｅ ｔ ｅ ｒ，ａ ｄ ｐ ｏｅ ｍｉ ａ ａ ｙ ｉ ｓｒ ｃ ｕ ｃ ｌ ａ ｒ ｔｏ ｃ ｉ ｕ ａ ｈ ｔｐ ｔ ｎ ｔ ｅ ｔ ｙ ｏ ｒ ｔｏ ｃ ｎ ｒ ｃ ｎ ｙ ａ ｓ ｎ ｒ ｔｏ ｅ ｎ ｌ ｓ ｕ ｓ ｉ ａ ｐ ｗ ｒ ｌ ａ ｐ ｏ ｃ ｏ ｉ ｅ ｔ ｙ ｌｎ ｕ ｃ ｉｎ ｌ ｒ ｔ ｉｓ ｓ ｏ ｅ ｆ ｐ ｒ ａ ｈ ｔ ｄ ｎ ｉ ｐａ ｔ ｆ ｎ ｔ ａ ｕ ｆ ｏ ｐ ｏ ｅｎ ．Ａｓ ａ ｍｐ ｒａ ｔ ｌｎ ｒ ａ ｅ ｌ ，ｃ ｌｒ ｐ ａ ｔ ｈ ｓ ｂ ｅ ｎ ｉ ｏ ｔ ｎ ｐ ａ ｔ ｏ ｇ ｎ ｌ ｅ ｈｏｏ ｌｓ ａ ｅ ｎ ｉｔ ｎ ｉｅｙ ｔ ｄ ｅ ｉ ｐａ ｔ ｒ ｔ ｏ ｃ ．Ｗ ｉ ｔ ｅ ｅ ｓ ｉｉ ｉ ｒ ｖ ｍｅ ｔ ｆ ｔ ｏ ｄ ｍｅ ｓｏ ａ ｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ ｎ ｎ ｅ ｓｖ ｌ ｓｕ ｉｄ ｎ ｌｎ ｐ ｏ ｅ ｍｉｓ ｔ ｈ ｓ ｎ ｉ ｖ ｔ ｍｐ ｏ ｅ ｎ ｏ ｗ — ｉ ｎ ｉ ｎ ｌ ｌｃ ｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ｈ ｔ ｙ ａ ｄ ｍａ ｓ ｐ ｃ ｒ ｍｅｒ ，ａ ｄ ｏ ｉｉ ｇ ｓ ｓ ｅ ｔｏ ｔ ｙ ｎ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｗｉ ｔ ｅ ｎ— ｃ ｅ ｓｎ ｄ ｔ ｂ ｓ ｉ ｆｒ ｔ ｎ ｒ ｍ Ａｒ ｂ ｄ ｐ ｉ， ｒ ｅ ｃ ｒ ａ ｄ ｔ ｈ ｉ ｈ ｒ ａ ｉ ｇ ａ ａ ａ ｅ ｎ ｏｍａｉ ｆ ｏ ｏ ａ ｉ ｏ ｓｓ ｉ ， ｏ ｎ ｎ ｃ
前沿空间蛋白质组学：一种强大的细胞生物学发现工具
前沿空间蛋⽩质组学：⼀种强⼤的细胞⽣物学发现⼯具真核细胞⾼度区室化，⽣物过程被分隔在不同的区室进⾏。
蛋⽩质功能与亚细胞定位密切相关，不同的区室提供不同的化学环境（例如pH和氧化还原条件）、不同的潜在作⽤配体或底物。
因此，对蛋⽩质亚细胞定位的严格控制是细胞⽣理学的重要调控内容。
⼤多数细胞⽣物学过程涉及蛋⽩质亚细胞定位的变化，例如转录因⼦在细胞核-胞浆的穿梭、细胞凋亡过程中线粒体蛋⽩的重新定位，以及细胞表⾯信号传导受体的内吞等。
相反，蛋⽩质的错误定位通常与细胞功能障碍和疾病相关，包括神经变性、癌症和代谢紊乱等。
以蛋⽩质空间定位为研究⽅向的空间蛋⽩质组现在已经⽤于揭⽰⼈类蛋⽩质组的复杂结构，如单细胞变异、动态蛋⽩质易位，相互作⽤⽹络改变，以及蛋⽩定位改变等。
⼀些研究者也已成功运⽤空间蛋⽩质组学来研究疾病，包括急性病毒感染、肝病等。
2019年5⽉，KTH 瑞典皇家理⼯学院的 Emma Lundberg 教授和德国马克斯-普朗克研究所的Georg H. H. Borner 教授，在国际著名期刊 Nature Reviews | Molecular CellBiology（IF=35.612）发表了题为《Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cellbiology》的综述性⽂章，系统介绍了空间蛋⽩质组学的技术、未来发展的机遇与挑战。
下⾯⼩编为⼤家解读⼀下这篇综述。
01空间蛋⽩质组学研究⽅法⽬前三种互补的⽅法可⽤于空间蛋⽩质组学研究：细胞器分级的质谱分析（图1）、蛋⽩质与蛋⽩质互作⽹络分析（图2），以及基于蛋⽩质定位的蛋⽩质成像（图3）。
1）基于质谱的细胞器分级⽅法质谱可⽤于复杂混合物中蛋⽩质的定性和定量研究。
空间蛋⽩质组学可借助传统⽣物化学分析⽅法，如下图1a 所⽰，通过定制的亚细胞分级分离（如，梯度离⼼或差速离⼼）来富集⽬标细胞器（绿⾊）。
然后利⽤质谱⽅法只分析富集到的组分。
蛋白质组学
（二）质谱技术
2-DE分离的蛋白经切胶回收、酶解后进行质谱分析
Edman测序：将蛋白肽链逐步化 学解聚，色谱鉴定酶解下来的氨 基酸，反推氨基酸序列
质谱测序：将蛋白肽链打碎电离，
通过测定分子碎片的荷质比，推 算出氨基酸组成和序列
三、荧光差异凝胶电泳技术2-DIGE
目的：显示不通样品中蛋白表达的差异，寻找差异表达蛋白
2-DIGE的定量原理
四、同位素亲和标签技术ICAT
2-DIGE的不足： 无法对分子量极高和极低、等电点极酸和极碱、含量极低的蛋白进行分离 ICAT的改进： 使用带有生物素和氘标记的ICAT标签标记 蛋白分子，利用8道尔顿的分子量差实现 相对定量
第二节 蛋白质的大规模分离鉴定技术
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 （一）蛋白质二维电泳技术2-DE
IEF
SDS-PAGE
蛋白质的结构
蛋白质是两性电解质，在不同PH下所 带的电荷不同：等电聚焦IEF 蛋白质的分子量和分子形状不同，电 泳迁移率不同：SDS-PAGE
2-DE数据库
蛋白质分离后可建立2-DE数 据库，用于鉴定和比较
（三）根据系统发育谱进行互作蛋白的预测
功能相关的(functionally related)基因，在一 组完全测序的基因组中预期同时存在或不存 在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称 作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列 没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相 似。可以推断它们在功能上是相关的。
输入细胞核：-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val输出细胞核：-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile输入线粒体：+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-LeuCys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu输入质体：+H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-SerSer-Asn-Ser-Phe-Leu- Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu- Gln-Gly输入过氧化物酶体：-Ser-Lys-Leu-COO输入内质网：+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-GluAla-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln返回内质网：-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-（KDEL） 由质膜到内体：Tyr-X-X-Φ
蛋白质组学质谱分析
百泰派克生物科技
蛋白质组学质谱分析
蛋白质组学质谱分析就是利用质谱技术分析研究蛋白质组。
质谱分析是蛋白质组学研究的关键技术之一。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质组学分析服务。
蛋白质组学
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的一门科学。
所研究的蛋白质组可以是特定条件下特定细胞类型中的蛋白质的集合，可以是来自生物体各种细胞蛋白质组的蛋白质的完整集合，也可以是某些亚细胞生物系统中蛋白质的集合（例如线粒体蛋白质组、病毒蛋白质组）等等。
分析蛋白质比分析核酸序列更加困难，因为只有4种核苷酸用来组成DNA，但至少有20种不同的氨基酸组成蛋白质。
很多方法可以用来
研究蛋白质、蛋白质组或整个蛋白质组，例如双向凝胶电泳、质谱分析、色谱分析等。
其中，质谱分析在蛋白质组学研究中是一个关键技术。
蛋白质组学质谱分析
蛋白质组学质谱分析是利用质谱技术分析研究蛋白质组。
蛋白质组学质谱分析研究包括在组学水平上对蛋白质进行鉴定、功能分析、表达差异分析和相互作用分析等。
常用的一些质谱方法包括MALDI（基质辅助激光解吸电离）、ESI（电喷雾电离）、PMF（肽质量指纹图谱）和串联质谱等。
以质谱技术为基础进行蛋白质组学研究具
有更好的灵敏度、精确度等特点。
肝细胞癌亚细胞器蛋白质组学初步探讨
的新鲜 的癌 组织和正 常肝组织 ，进行双向 电泳，Ｐ Ｄ Ｑ ｕ ｅ ｓ ｔ 软件 筛选差异显著的蛋 白质 点，Ｍ Ａ Ｌ Ｄ Ｉ — Ｔ Ｏ Ｆ ／ Ｍ Ｓ 质 谱仪 鉴定差异蛋 白，并对差异蛋 白进行功 能分类 ，推 测其可能的致病机制 。结果 ①肝癌组织与正常组织 的细胞质蛋 白表达差异：有统计学差异 （ 尸＜０ ． ０ ５ ）的差异蛋 白点共有 ３ １ 个， 其 中在癌组织中表达上调 （ ＞ ２ 倍 ）的有 １ ８ 个 ，下调 （ ＞２ 倍 ）的有 ｌ ３ 个 。这些差异蛋 白主要 与凋亡 、细胞骨架 、分泌跨 膜蛋 白等相 关； ②肝癌 组织 与正常组织的细胞核蛋 白表达差异 ：有统计学差异 （ 尸＜０ ． ０ ５ ）的差 异蛋 白点共有 ２ ７ 个 ，其 中 在癌组 织中表达上调 （ ＞２ 倍 ）的有 １ ４ 个 ，下调 （ ＞２ 倍 ）的有 １ ３个。这些差异蛋 白主要 与细胞增殖 、蛋 白迁移等相 关。结 论 Ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ，ｃ ｙ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｉ ｃ １ 和Ｒ ａ ｓ 相 关蛋 白可能是 潜在的肝癌标记物 ，深入研 究这些蛋
ｏ ｆ ２ Ｄ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ Ｐ ＤＱ ｕ ｅ ｓ ｔ ｓ ｏ ｆ ｔ ｗａ ｒ ｅ ， ａ ｎ ｄ ｈｅ ｔ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ＭＡ Ｌ ＤＩ Ｔ Ｏ Ｆ ／
ｐ ｒ ｏｔ ｅ ｉ ｎｓ ， ａ ｎｄ ａ ｎａ ｌ ｙｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｌ ａｔ ｉ ｏ ｎｓ ｈｉ ｐ ｂｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ ｔ ｈｅ ｄｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎｔ ｉ ａ ｌ ｌ ｙ ｅ ｘｐ ｒ ｅｓ ｓ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏｔ ｅｉ ｎｓ ａ ｎ ｄ Ｈ ＣＣ． Ｍ ｅ ｔ ｈｏｄｓ Ｔｗ ｅ ｌ ｖｅ
生化名词解释
蛋白质学【proteomics】蛋白质组学是指采用各种大规模蛋白质分离和识别技术研究手段来研究蛋白质组的一门科学。
目前，蛋白质组学作为基因组DNA序列与基因功能之间的桥梁，通过蛋白质的鉴定、定量检测、细胞或亚细胞分布、修饰状态、相互作用研究等，揭示蛋白质功能。
代谢组学【metabolomics】代谢组学指通过对某一细胞、组织、器官或者体液内所有代谢物进行高通量检测、定性和定量分析，研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化，尤其是内原代谢、遗传变异、环境变化及各种物质进入代谢系统的特征和影响，并寻找代谢物与生理病理变化相对应关系的研究方式的科学。
RNA组学【RNonmics】RNA组学是从基因水平系统研究细胞中全部非编码RNA分子的结构与功能，从整体水平阐明RNA的生物学意义的科学。
RNA组学作为后基因组时代一个重要的前沿科学。
是基因组学和蛋白质组学研究的扩充和延伸。
RNA组学重在揭示由RNA介导的遗传信息表达控制网络，以不同于蛋白质编码基因的角度来注释和阐明人类基因组的结构与功能，为人类疾病的研究和治疗提供理论基础。
生物信息学【Bioinformatics】生物信息学是伴随着基因组的研究加之计算机信息管理技术的快速发展而诞生的一门新兴的交叉学科。
它以生物大分子为研究对象，以计算机为主要工具，发展各种软件，对日益增长的DNA和蛋白质的序列和结构进行收集、整理、储存、发布、提取、检索与分析，揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘，已到达理解这些生物大分子信息的生物学意义。
糖复合物【glycoconjugates】糖复合物是由聚糖以共价键与蛋白质或脂类结合形成的化合物。
包括糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂。
N—连接糖链【N-linked glycosylation】糖蛋白分子中，糖链的N—乙酰葡糖胺与多肽链的天冬酰胺残基的酰胺氮连接，形成N—糖苷键，此种糖链为N—连接糖链，也称N—连接聚糖。
连接点的结构为：GlcNAcβ-N-Asn。
蛋白亚细胞定位方法
蛋白亚细胞定位方法
蛋白质的亚细胞定位是指确定蛋白质在细胞内的具体位置。
这对于理解蛋白质的功能和细胞生物学过程至关重要。
以下是一些常用的蛋白质亚细胞定位方法：
1. 免疫荧光技术：这是一种基于抗体特异性结合的方法。
通过使用针对目标蛋白质的特异性抗体，将其标记上荧光染料，然后观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞定位。
2. 荧光蛋白标记：将目标蛋白质与荧光蛋白（如GFP、RFP 等）融合表达，使其在细胞内发出特定颜色的荧光。
通过观察荧光的分布，可以确定蛋白质的亚细胞定位。
3. 细胞器特异性染料：使用细胞器特异性染料对细胞进行染色，然后观察目标蛋白质与这些染料的共定位情况。
例如，使用线粒体染料可以确定蛋白质是否定位于线粒体。
4. 免疫组织化学技术：该方法用于检测组织切片中的蛋白质定位。
通过使用针对目标蛋白质的抗体，将其标记上可见的染料，然后观察染料在组织切片中的分布。
5. 蛋白质相互作用分析：通过研究蛋白质与其他已知亚细胞定位的蛋白质之间的相互作用，可以间接推断目标蛋白质的亚细胞定位。
这些方法可以单独使用，也可以结合使用，以提高蛋白质亚细胞定位的准确性。
在进行蛋白质亚细胞定位研究时，需要选择合适的方法，并结合其他实验手段进行综合分析。
临床蛋白质组学
临床蛋白质组学
临床蛋白质组学指用于临床研究的蛋白质组学，主要是研究患者与健康个体间的差异蛋白质或是疾病不同阶段的差异蛋白质，以辅助临床诊断和治疗。
百泰派克生物科技提供基于质谱的临床蛋白质组学分析服务。
临床蛋白质组学
蛋白质组学分析包括鉴定蛋白质表达的变化、翻译后修饰、蛋白质-蛋白质相互作用、细胞和亚细胞分布以及蛋白质表达的时间模式。
差异蛋白质组学和功能蛋白质组学的目的是获取这些信息，从而提高人们对细胞和生物体中细胞途径及其相互关系的理解。
蛋白质组学作为发现生物途径和疾病过程的工具的功能现已得到广泛认可。
事实上，蛋白质组学已经发现了许多针对各种疾病的潜在的新药靶点。
当前的蛋白质组学时代开始研究这种技术如何为临床医生提供服务，临床蛋白质组学也因此出现。
液相色谱与质谱联用是临床蛋白质组学高通量技术手段中的一种。
临床蛋白质组学。
临床蛋白质组学研究内容
临床蛋白质组学的目的主要是为高通量诊断和预后应用提供服务，因此临床蛋白质组学研究内容主要是患者与健康个体间的差异蛋白质或是疾病不同阶段的差异蛋白
质，从而发现与疾病发生或进展相关的生物标志物和潜在的药物靶标。
蛋 白 质 组 学
5. 蛋白质不能动态反映生物系统所处的状 态。
二.蛋白质组与蛋白质组学的概念 蛋白质组与蛋白质组学的概念 1. 蛋 白 质 组 (Proteome) ： 1994 年 由 澳 大 利 亚 Macquarie大学的学生 大学的学生Wilkins和他的老师提出， 和他的老师提出， 大学的学生 和他的老师提出 最早见文献是1995年 7月的 “ Electrophoresis” 月的“ 最早见文献是 年 月的 杂志上。指基因组表达的所有相应的蛋白质， 杂志上。 指基因组表达的所有相应的蛋白质， 也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其 活动方式。 活动方式。 2.蛋白质组学： 研究细胞内全部蛋白质的组成及 蛋白质组学： 蛋白质组学 其活动规律的科学。 其活动规律的科学。
人的各种体液被用于研究与某些疾病的关 系.最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究 最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究 眼泪中的蛋白质与生理状态的关系.他们发现了 眼泪中的蛋白质与生理状态的关系 他们发现了 一种新的蛋白质,这个蛋白质非常相似于在乳腺 一种新的蛋白质 这个蛋白质非常相似于在乳腺 癌细胞里高表达的另一种蛋白质.这个发现可能 癌细胞里高表达的另一种蛋白质 这个发现可能 会提供疾病诊治的新的手段.在一项利用蛋白质 会提供疾病诊治的新的手段 在一项利用蛋白质 组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发 乙醇会改变血清蛋白糖基化作用,导致许多 现,乙醇会改变血清蛋白糖基化作用 导致许多 乙醇会改变血清蛋白糖基化作用 糖蛋白的糖基缺乏,如转铁蛋白 如转铁蛋白。 糖蛋白的糖基缺乏 如转铁蛋白。
蛋白质组学 的研 究内容
表达 蛋白质组学
结构 蛋白质组学
功能 蛋白质组学
表达蛋白质组学
研究细胞所表达的蛋白质种类
化学生物学专业博士研究生课程精选全文
可编辑修改精选全文完整版化学生物学专业博士研究生课程教学大纲课程名称：蛋白质组学及应用课程编号：0703201F08学分：2总学时数：40开课学期：第2学期考试方式：笔试课程说明：（课程性质、地位及要求的描述）随着人类基因测序的基本完成，人类基因组计划开始进入后基因组时代。
蛋白质组学(Proteomics)已成为功能基因组学的重要研究领域，是当今生命科学研究的热点与前沿领域。
本课程主要从蛋白质组与蛋白质组学的基本概念入手，重点介绍这一崭新领域的诞生与发展，并以具体的研究成果，详细介绍蛋白质组学研究的相关技术及应用进展。
通过本课程的学习，使学生了解和掌握蛋白质的结构、功能基因组和蛋白质组、蛋白质组学研究的方法及相关分离、分析、检测、鉴定技术，蛋白质组学研究中的生物信息学及蛋白质组学的应用等，如肿瘤发生与发展的比较蛋白质组学、细胞凋亡的蛋白质组学、蛋白质组学与新药开发等方面的知识。
本课程主要适用于化学、化工、生物、医学等学科领域的研究生选修。
教学内容、要求及学时分配：第一章功能基因组与蛋白质组(2学时)1. 基因组、蛋白质组研究中的基本概念、相互关系2. 蛋白质组学研究的内容和意义3. 蛋白质组学的特点和难点及蛋白质组学发展趋势本章要求：了解基因组、蛋白质组研究中的基本概念、相互关系，蛋白质组学研究的内容和意义。
蛋白质组学的特点和难点及蛋白质组学发展趋势。
第二章蛋白质的结构与表征(2学时)1. 蛋白质的组成、分类2. 蛋白质的一级、二及、三级结构等基本概念3. 蛋白质结构与功能的关系4. 蛋白质结构分析的方法和技术本章要求：了解蛋白质的组成、分类、一级、二及、三级结构等基本概念，蛋白质结构与功能的关系，蛋白质结构分析的方法和技术等。
第三章蛋白质组学研究方法(3学时)1. 蛋白质组学研究的方法和技术2. 二维凝胶电泳技术3. 多维色谱分离技术4. 生物质谱鉴定技术本章要求：了解蛋白质组学研究的方法和技术，如二维凝胶电泳技术、多维色谱分离技术、生物质谱鉴定技术等。
蛋白质亚细胞定位及其生物学意义研究
蛋白质亚细胞定位及其生物学意义研究蛋白质是生命中最基本的分子之一，它们在细胞中承担着各种各样的功能。
而这些功能的实现，往往与蛋白质定位有着密不可分的关系。
在细胞内，一种蛋白质的定位地点与其功能密切相关，探究蛋白质亚细胞定位及其生物学意义，是现代生物学的一个重要研究方向。
一、亚细胞定位的基本概念亚细胞定位指的是蛋白质在细胞内的分布位置和存在方式。
具体来说，亚细胞定位包括蛋白质位于哪些细胞器上，蛋白质是否贴附在细胞膜上，以及蛋白质是否存在于细胞外液中等。
这些细胞学层面的问题对于我们理解蛋白质的功能、特性以及相互作用等方面都具有很重要的意义。
二、蛋白质亚细胞定位的研究方法研究蛋白质亚细胞定位的方法包括生化学和细胞学方法。
其中，最为常用的是免疫荧光技术、酵母双杂交技术、蛋白质标记技术以及生物信息学分析等。
这些方法不仅能够帮助科学家们研究蛋白质在细胞内的分布位置和定位机制，还能够揭示细胞中各种生物学现象的本质和原理。
三、蛋白质亚细胞定位的生物学意义蛋白质亚细胞定位对于生物学的意义非常重大。
它不仅能够帮助我们深入理解蛋白质功能和相互作用的机制，还可以为疾病的诊断和治疗提供有力的支持。
例如，通过对受损组织细胞的蛋白质亚细胞定位的研究，科学家们可以更加精确地确定细胞损伤的类型和程度，进而指导临床医生进行治疗。
四、未来发展方向随着分子生物学、细胞生物学、生物信息学等新技术的发展，蛋白质亚细胞定位研究也在不断进步。
未来，我们可以借助新技术进一步研究蛋白质在不同组织和不同生理状态下的定位变化和变化机理，深入挖掘蛋白质定位与功能的关系，进而推动生物学、医学等领域的发展。
总之，蛋白质亚细胞定位及其生物学意义研究是一个非常重要的前沿课题，它关乎着我们深入理解生命本质的过程。
在未来的研究中，我们需要继续秉承科学研究的精神，不断完善研究方法，从而开创更加光明的科研未来。
10-亚细胞蛋白质组学
(subcellular proteomics)
亚细胞蛋白质组是亚细胞结构如亚细胞区室、特 定蛋白质组分、细胞器等所包含的所有蛋白质。 亚细胞蛋白质组学，就是针对细胞内不同区域 结构、功能单位的蛋白质组学研究；或者说是利用 蛋白质组学研究技术来分析一种组织或细胞的某一
亚细胞结构的蛋白质组成。
亚细胞蛋白质组学研究的着眼点是在蛋白质组的
特定成分，而非整个蛋白质组。
亚细胞蛋白质组学的技术基础在于对亚细胞组分
的分离纯化。
Байду номын сангаас
亚细胞蛋白质 组的研究策略
亚细胞蛋白质组的研究策略：
1. 亚细胞组分的分离
2. 亚细胞蛋白质组学技术
3. 蛋白质亚细胞定位技术
4. 蛋白质亚细胞定位预测技术
亚细胞定位和蛋白功能
亚细胞定位和蛋白功能
蛋白质在细胞内的定位是蛋白质功能的基础，它能够影响蛋白质在细胞生命活动中的参与方式，因此对于蛋白质亚细胞定位的研究是十分重要的。
目前，常见的蛋白质亚细胞定位有细胞核定位、质膜定位、粒腺定位、紧贴膜定位以及胞质基质定位等。
细胞核定位是指蛋白质被定位到细胞核内，并在该位置发挥作用。
细胞核作为细胞最重要的生物学结构之一，承担着细胞的DNA复制、转录和修复等生物学功能。
因此，细胞核定位的蛋白质通常是具有生物学功能的重要分子，例如转录因子、DNA结合蛋白、RNA加工蛋白等。
质膜定位是指蛋白质被定位在细胞质膜上，该定位通常是由蛋白质的C端负电荷、氢键、疏水性等特性决定的。
细胞质膜是一组拥有重要的信号传导、物质交换和细胞黏附等生物学功能的蛋白质。
质膜定位的蛋白质通常是在细胞外和细胞内部之间起到沟通和交换物质作用的分子，例如细胞质膜上的受体、通道蛋白、转运蛋白等。
粒腺定位是指蛋白质被定位在粒腺内，粒腺是细胞内主要参与合成和分泌蛋白质的细胞器之一，通常存在于内分泌细胞、淋巴细胞、浆细胞等细胞类型中。
粒腺定位的蛋白质通常是参与细胞内分泌过程的分泌蛋白质，例如肽激素、免疫球蛋白等。
蛋白质亚细胞定位对其功能的影响十分重要。
以细胞核定位的蛋白质为例，这类蛋白质具有舒卡尔转录因子家族、TrxG家族、Pou家族等重要蛋白质。
这些蛋白质能够结合基因调节区域，调控基因的转录水平，影响细胞生长、分化和凋亡等生理生化过程。
逆之，若这些蛋白质定位到胞质中，则将失去其参与核内生物学过程的能力。
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1.18~1.23
1.18~1.26 1.06~1.15 1.14~1.19 1.07~1.16 1.06~1.16
1.19~1.22
n.a. 1.03~1.07 1.12~1.15 1.05~1.12 1.05~1.10
高尔基体（完整）
高尔基体（小泡） 肌质网 叶绿体 植物线粒体
1.05~1.12
以人为例，基因组分析表明，人具有3万~5万个基因，经过剪 切和翻译后修饰产生更多的蛋白质种类；受蛋白质等电点极限、 疏水性、相对分子质量范围以及蛋白质丰度限制，很难由2-DE技 术一步到位地获得生物体的全蛋白质组。
蛋白质的亚细胞定位对蛋白质生物功能的发挥起到 极关键的作用，蛋白质亚细胞定位信息强烈暗示着其 生物学功能。
时间/min
5~10 30 (5) 10~15 10~20 10~20 30~60 30~60 10~15 30~60 30~60 20~30 20~40 20 10 15
14
* 核膜的制备物是否是完整的包膜，它的沉降速率取决于制备的方式。
密度梯度离心 (isodensity centrifugation)
6
二、亚细胞蛋白质组学的意义
1. 富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组
2. 提供蛋白质的亚细胞定位信息 3. 加深对亚细胞组分的结构功能理解 4. 加深对细胞生理分子机制的理解
5. 利于亚细胞蛋白质组的差异表达谱研究
7
三、亚细胞蛋白质组学的技术基础
亚细胞组分的分离纯化 （一）亚细胞组分的分离
蛋白质组学技术研究
RCF/g
500~1 000 2 000 (30 000) 1 000~10 000 6 000~15 000 6 000~15 000 30 000~100 000 50 000~100 000 1 000~3 000 50 000~100 000 50 000~100 000 10 000~20 000 50 000~100 000 10 000~35 000 1 000~2 000 5 000~20 000
力研磨或剪切
2、亚细胞组分的分步分离
差速离心 与密度梯度离心 联用
10
差速离心 (differential centrifugation)
是利用样品中各种组分的沉降系数不同而进行分 离的方法，又称差分离心或差级离心。通常两个组分 的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。
11
优点：样品处理量较大，可用于大量样品的初
蛋白质在胞浆合成后，须在N端分拣信号 (sorting signal) 的 指引下到达不同亚细胞部位发挥生物学功能。常用于蛋白质亚细 胞预测的各种分拣信号包括：信号肽 (signal peptide, SP)、线粒
体引导肽 (mitochondrial targeting peptide, MTP)、叶绿体运
23
哺乳动物细胞膜的主要酶分布特点
膜成分
细胞膜
顶端膜 基底膜 5’-核苷酸酶、亮氨酸氨肽酶、碱性磷酸酶 Na+/K+-ATP酶、激素控制的腺苷酸环化酶 5’-核苷酸酶、 Na+/K+-ATP酶 琥珀酸脱氢酶 Β-半乳糖苷酶、酸性磷酸化酶、芳基硫酸酯酶 过氧化氢酶、尿酸酶 半乳糖苷转移酶 NADPH (或NADH-)细胞色素c还原酶 核苷酸三磷酸酶
内容物
细胞核，重线粒体，大片细胞膜 重线粒体，细胞膜碎片
线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，完整高尔 基体
线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体 溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体膜，大的 高密度小泡（如粗面内质网） 从内质网而来的所有小泡，细胞膜，高尔基 体，核内体等
注：RCF即相对离心力。
13
细胞器的大小和沉降特性
线粒体蛋白质
分泌蛋白 核蛋白质
识别MTP
识别SP 识别NLS
Predotar
TMHMM HMMTOP SobLoc NNPSL
http://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-2.0 http://www.enzim.hu/hmmtop/ /SubLoc /nnpsl
亚细胞成分
细胞核
密度/（g· cm-3）
蔗糖
>1.30
低渗透压介质*
1.21~1.24
核膜
线粒体 Mitoplast 线粒体质 溶酶体
1.18~1.22
1.17~1.21 1.44 1.19~1.21
n.a.
1.15~1.20 n.a. 1.10~1.15
过氧化物酶体
粗面内质网 光面内质网 细胞膜 大片 小片 核内体
等密度区带离心法是根据样品组分的密度差别
进行分离纯化。
16
密度梯度离心介质
蔗糖梯度
便宜，溶解度高，能够制备分离绝大多数成分所要求的密度范围的溶液， 最常用；
高浓度时黏性大，且渗透压高。
Ficoll Percoll Nycodenz Metrizoate
17
亚细胞成分在蔗糖和低渗透压介质中的密度
亚细胞成分
细胞核 核膜* 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 粗面内质网小泡 光面内质网小泡 胞膜 大片 小泡 核内体 高尔基体(完整) 高尔基体(小泡) 肌质网 叶绿体 植物线粒体
大小/μm
4~12 0.4~2.5 0.4~0.8 0.4~0.8 0.05~0.35 0.05~0.3 3~20 0.05~2.0 0.05~0.4 1.0~2.0 0.05~0.5 0.1~1.0 2~5 1~3
Western blot TAP (tandem
affinity purification)
电镜技术 荧光显微镜技术
endoБайду номын сангаас-YFP
(apoptotic endonuclease)
Mitochondria Co-localization
26
（四）蛋白质亚细胞定位预测技术
亚细胞定位预测主要基于蛋白质氨基酸序列的三个 方面的特性：氨基酸组成特点、分拣信号的识别以及氨 基酸序列的进化保守性。
亚细胞蛋白质组学
基础医学院 病理生理学教研室
刘 芸
1
授课提纲
第一节
第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
概论
细胞膜的蛋白质组学研究进展 高尔基体蛋白质组学研究进展 核孔复合体蛋白质组学研究进展 核仁蛋白质组学研究进展 线粒体蛋白质组学研究进展 展望
2
第一节 概论
真核生物体是一个复杂系统。
1.05~1.12 1.04~1.08 1.18~120 1.16~1.19
1.03~1.08
1.03~1.08 n.a. 1.10~1.13 n.a. 18
注：n.a. 为未得到数据； * 这些数据是在Nycodenz、 Metrizoate或Percoll中的密度。
（一）亚细胞组分的分离
3、免疫共沉淀法 (Co-IP) 分离信号复合体
4类亚细胞定位
12种亚细胞定位
SignalP、ChloropP和 MTP识别三者相结合
氨基酸组成与分拣 信号识别相结合
注：CTP 叶绿体运输肽 (chloroplast transit peptide) ; NLS 核定位信号 (nuclear localization signals); MTP 线粒体引导肽 (mitochondrial targeting peptide); SP 信号肽 (signal peptide)。 28
(Signaling complex )
19
基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
Y X
agarose
G
agarose
G
agarose
G
20
实验设计思路
21
5
一、亚细胞蛋白质组学的内涵
大分子结构体 (macromolecular structure)或多 蛋白质复合体 (multiprotein complex)
如核基质 (nuclear matrix)、剪接体 (spliceosome )、纺锤体 (spindle pole)、核孔结构 (nuclear pore complex)以及核糖体 (ribosome)等。
又称为区带离心，是将样品溶液臵于一个由梯度材 料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区 带层分布于梯度柱中。按照离心分离原理，梯度离心 又可分为速率区带离心法 (又称连续密度梯度离心法)和 等密度离心法 (又称不连续密度梯度离心法)。
15
速率区带离心法是根据样品中不同组分粒子
所具有的不同体积尺寸大小和不同沉降系数进行分离。
（一）亚细胞组分的分离
4、亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分
根据细胞或亚细胞组 分中不同种类的翻译后修 饰特性可望用来分离各类 被修饰的蛋白质。
22
（一）亚细胞组分的分离
5、分离纯化效果的评价
判断亚细胞分离纯化是否成功，可以用光学或电子
显微镜监测，或者检测蛋白质浓度或合适的标志酶。
纯化过程中跟踪合适的标志酶的活性可以确定目的细胞器 的产率和污染其他细胞器成分的程度。 通过在纯化过程中确定蛋白质的浓度，计算每一步的比活性 （活性与蛋白质的比率），可以用来估算富集程度或纯化倍 数。
预测功能
叶绿体蛋白质
预测依据
识别CTP
MitoProt
SignalP predictNLS
http://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj /medgen/mitofilter