免疫组织化学技术(ABC法)
免疫组化的原理与操作
化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
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二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或称SP法。
（B ★为生物素标记的过氧化物酶）
AB★C复合物是avidin与酶联biotin 在使用前30min 配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下 1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。
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（1）ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理：
特点：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景 也更清晰。
特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高；
（2）可定性、定位、定量观察；
（3）将形态学改变与功能和代谢变化结
合起来；
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IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。
荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗 体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→ 检测抗原。
优点：简单，时间短， 特异性强。
缺点：灵敏度低，所 需抗体量大 （不经济）。
应用：基本不用了！！
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常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组化试题参考答案
免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。
注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。
免疫组化abc法名词解释
免疫组化abc法名词解释
免疫组化ABC法是一种用于检测蛋白质在组织切片中表达的方法。
这种方法通常用于病理学研究和临床诊断中。
ABC法的全称是Avidin-Biotin Complex法，它利用了生物素和亲和素之间的特异性结合来实现对蛋白质的检测。
在ABC法中，首先需要利用一种特异性的抗体来与待检测的蛋白质结合。
这个抗体通常被称为一抗，它可以识别并结合到特定的蛋白质上。
接下来，将生物素标记的二抗加入样本中，这些二抗能够与一抗结合。
然后，将含有酶的生物素-链霉素复合物（ABC）加入样本中，这个复合物可以结合到二抗上。
最后，加入染色底物，这样就可以通过显色反应来观察蛋白质的表达情况。
ABC法的优点包括灵敏度高、特异性好、操作简便等，因此被广泛应用于免疫组化实验中。
然而，也需要注意到ABC法在操作过程中可能存在的非特异性结合和背景信号的问题，需要进行严格的实验控制和数据分析。
总的来说，免疫组化ABC法是一种重要的实验技术，它通过利
用生物素和亲和素的结合特性，能够有效地检测组织切片中蛋白质的表达情况，对于研究和诊断具有重要意义。
免疫组化 ABC法
免疫组化染色步骤(ABC法)第一天：【准备：试剂、37℃恒温水箱打开】1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol 内浸泡5min。
【二甲苯→二甲苯→100% Alcohol→100% Alcohol→95% Alcohol→90% Alcohol→80% Alcohol→70% Alcohol】2．TBS洗10 min×3，置摇床上。
3．【注意避光】用0.3% H2O2和0.3%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上。
增加切片渗透性。
【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2】4．TBS洗10 min×3，置摇床上。
5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL 0.05M Citrate buffer（或0.05M Tris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95o C左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．TBS洗10 min×3，置摇床上。
【如果掉片严重，5、6和3、4调换一下】7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20 -30 min。
8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。
加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。
9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。
第二天：【准备：37℃恒温水箱打开】10. 取出湿盒（室温30 min，恢复到室温），将抗体倒掉，TBS洗10 min×3，置摇床上。
11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12. 取出湿盒，将Π抗倒掉，TBS 洗10 min×3，置摇床上。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学SABC法
结果判断标准
一些原则必须掌握： 阳性细胞定位要在5%以上，才能定为阳性。 参考评价： <5% - ， 5%-25% + ， 25%-50% ++， >50% +++ ～++++
P53
雌激素受体β在乳腺癌的表达
免疫组织化学SABC染色法
原理：
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度
亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过
氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后
与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。
用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复 合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗— ABC。最后用底物显色剂显色。
(3) 3%过氧化氢溶液，10min；
(4) PBS浸洗，×3次； (5) 使用封闭剂：每张切片滴加非免疫动物（羊）血 清(与二抗同源)室温 10min；倾去血清，不洗！ (6) 每张切片滴加小鼠抗人CEA单抗（1:100）， 37℃ ，30min，或4℃过夜； (7) PBS浸洗，3次；
(8) 每张切片滴加第二抗体(1:100)，37℃，
⑴ lgG (anti-Mouse)
⑵ lgG (anti-Rabbit)
Straptived- HRP 复合物（SABC） A液（avidin） ：亲和素 B液（biotin） ：生物素-HRP
显色剂： 浓缩DAB H 2O 2 Buffer
实验步骤:
(1) 结肠癌石蜡切片脱蜡下行酒精入水； (2) PBS浸洗，×3次；
20min； (9) PBS冲洗，×3次； (10)每张切片加100lSABC溶液(1:100)，37℃， 20min； (11)PBS冲洗，×3次； (12)新鲜配制的底物 DAB溶液，3～5min； (13)自来水冲洗，脱水，透明，中性树胶封固。
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中的应用
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中的应用
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中起着重要的作用。
通过免疫组织化学方法，可以检测肺癌组织中的特定分子标志物，从而帮助确定肺癌的诊断和分型。
常用的免疫组织化学标记物包括细胞角蛋白、肿瘤标志物、细胞增殖指标等。
例如，通过检测细胞角蛋白的表达，可以确定肺癌的细胞来源和类型。
肿瘤标志物如细胞表面抗原（如
CK7、CK20）和肿瘤相关抗原（如CEA、NSE）的表达可以
帮助区分肺癌的类型和分级。
此外，细胞增殖指标如Ki-67的
表达可以反映肿瘤的增殖活性，有助于判断肺癌的恶性程度。
免疫组织化学方法可以通过染色反应来显示标记物的表达情况。
在肺癌病理诊断中，常用的免疫组织化学染色方法包括免疫组化ABC法和免疫组化热敏法。
这些方法可以通过染色反应的
强度和位置来确定标记物的表达情况，进而判断肺癌的类型和分级。
总的来说，免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中具有高灵敏度和高特异性的优势，可以提供更精确的肺癌诊断和分型结果，对于制定个体化治疗方案和预后评估具有重要意义。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
免疫组化ABC法
免疫组化ABC法
1、石蜡切片脱蜡入水
2、蒸馏水洗一下
3、枸橼酸缓冲液微波90℃二遍（间隔3分钟）
4、自然冷却（也可速冷）
5、3%过氧化氢10分钟
（此步骤主要是阻断内原酶，减少背景着色。
用过氧化氢加水1：10稀释，例如：双氧水0.6ml加蒸馏水5.4ml）
6、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
7、正常血清封闭10分钟（此步骤主要是阻断非特异性反应，简少背景的着色）
8、不冲洗，擦干周围，加一抗（乳头瘤病毒一抗效价：1：10000）
9、一抗4℃过夜（此步骤主要是显示反应物质）1：100室温40-60分钟
10、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
11、加二抗，37℃，30分钟（羊抗兔IgG室温20分钟。
生物素B标记，效价：1：40000）
12、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
13、加三抗（SABC）30分钟（室温20分钟）
14、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
15、DAB显色（显色时间在镜下控制）
配方：
一、抗原修复液
A液9ml
B液41ml
双蒸水450ml
（A液：枸橼酸2.1g加蒸馏水100ml，B液：枸橼酸钠14.71g加蒸馏水500ml）二、一抗
一张标本 40ul
1：200=X：1500 1：抗体
X= ————=7.5ul 200：稀释倍数
抗体：7.5ul，PBS1450ul 1500：所配试剂毫升数
三、DAB
蒸馏水1ml B+C+A 各一滴。
免疫酶染色技术(ABC法)检测各类免疫细胞的数量
免疫酶染色技术（ABC法）检测各类免疫细胞的数量抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。
免疫酶染色技术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分子遇到底物时，能催化底物水解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。
该方法具有敏感性高，标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就能观察等优点。
但有时也存在非特异性染色影响。
【基本原理】将亲合素与酶标生物素反应形成复合物（Avidin-Biotin- Peroxidase Complex，ABC），再与生物素化的第二抗体反应，借助与T细胞反应的抗人T细胞亚群的McAb（第一抗体）介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。
【试剂及材料】（1）缓冲甲醛-丙酮固定液（pH6.6）（2）pH7.4 PBS（3）正常马血清（4）生物素结合的抗鼠IgG抗体（5）1％H2O2-甲醇溶液：配制后立即使用。
（6）标准ABC试剂盒：其中A试剂为亲合素，B试剂为辣根过氧化物酶结合的生物素。
（7）二氨基联苯胺（DAB）（8）0.5％硫酸铜；0.15mol/L NaOH溶液（9）苏木紫溶液（10）替代水:NaHCO3 8g，无水硫酸镁40g，加自来水4L溶解。
【操作方法】（1）用PBS调整PBMC浓度至106/ml；加100μl淋巴细胞悬液于甩片机孔内，500r/min离心5min，制片；将载有细胞单层的玻片在室温空气中暴露2～3min，稍干即置于缓冲甲醛-丙酮液中，4 ℃固定30s，取出用PBS漂洗后再浸于PBS中；（2）于每一玻片的细胞单层上加100μl用PBS配制的2％马血清，在湿盒中作用20min，浸于PBS 中；（3）加一抗:将抗CD3、CD4和CD8McAb（用含2％马血清的PBS•稀释成一定浓度）100μl分别加在玻片细胞单层上，并设阴性对照。
免疫组化ABC法
HRP
步骤：三步法
优点：敏感性较高
特异性强 应用范围广
缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰
Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中 磷脂有非特异反应
免疫组化ABC法
实验步骤
• 一、切片和脱蜡 • 切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后 进行后续反应。步骤如下：
• （1）二甲苯脱蜡
• （2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒精、 90%酒精、85%酒精、80%酒精） • 二、微波修复抗原
• （11）贴片，甘油封片
• 四、观察结果并分析
免疫组化ABC法
实验对照设置
对照染色的目的 ---排除假阴性和假阳性。
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑶一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛 血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的
0.01 mol/L PBS稀释(下同)；
• ⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; • ⑸生物素化二抗室温孵育2h;
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
⑺ABC(1:100, Vector) 室温2h; • ⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; ⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris 盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。
免疫组化ABC法
实验步骤
• （10）0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
免疫组化 ABC法
一 ABC法 实验原理
组织抗原
第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 亲和素
原理：酶标记Biotin形成酶素化
Biotin 酶 素 化 Biotin ＋ Avidin--- ABC复合物 抗 原 --- 特 异 抗 体 --Biotin 标 记 二 抗 --Avidin ● Biotin ●
免疫组织化学技术(ABC法)
免疫组织化学技术（ABC法）大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x 100和0.03%H2O2的0.01%磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4 )，室温30min；含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)的PBS，室温30 min；豚鼠抗HAP1 抗体（1:30000），4℃孵育48h；PBS漂洗3 次，每次10min；生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min；ABC 复合物(1:100)，2小时；PBS漂洗3次，每次10min；含0.03%DAB和0.006%H2O2的Tris盐酸缓冲液（pH7.6）室温13min；常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。
以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。
鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。
A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。
C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。
D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析，*示与对照组比较，P<0.01。
比例尺为100μm。
E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析，▲示与对照组比较，P<0.01。
免疫荧光双标技术脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS，室温30 min，含2%正常羊血清(NGS)和3%BSA的PBS，室温30min，入豚鼠抗HAP1抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100)，4℃孵育48h；PBS 漂洗3 次，每次10 min，加入Rodamine Red或FITC 标记的驴抗豚鼠或兔IgG（1:500），室温闭光2h，PBS 闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。
荧光显微镜观察，FITC 用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm氩氪激光激发，用570nm滤光片检测。
快速微波ABC法免疫组织化学技术的研究
快速微波ABC法免疫组织化学技术的研究
马大烈;詹镕洲;黄玲;谢企良
【期刊名称】《第二军医大学学报》
【年(卷),期】1991(12)6
【摘要】随着免疫组织化学方法学的进展,其敏感性和特异性已得到显著提高。
然而,目前常用的方法既费时又增加了非特异背景染色和脱片机会。
近年来,有资料表明,微波辐社在免疫组化技术中的应用不仅克服了上述缺点,而且可获得令人满意的染色效果。
作者将微波与ABC(Avidinbiotin complex)法相结合,应用多种单克隆及多克隆机体对不同类型的良恶性肿瘤进行了免疫组化标记,并与常规ABC法进行比较,以探讨该法的特异性、稳定性和实用价值。
【总页数】3页(P573-575)
【关键词】微波;免疫组织化学;ABC法
【作者】马大烈;詹镕洲;黄玲;谢企良
【作者单位】长海医院病理科;长海医院理疗科
【正文语种】中文
【中图分类】R446.61
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一种组织块免疫细胞化学ABC法
一种组织块免疫细胞化学ABC法
张致身
【期刊名称】《《首都医科大学学报》》
【年(卷),期】1992(000)001
【摘要】免疫细胞化学ABC法是1981年由Hsu等首先介绍的一种高灵敏的免疫过氧化物酶程序。
此后,国内外陆续有应用此法进行研究的报告,其程序是,组织块先行切片,随后切片依次入未被标记的第1抗体、生物素标记的桥抗体以及卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)中孵育,经酶反应显示抗原存在的位置和数量,从而观察抗原在组织或细胞中的定位和分布。
【总页数】1页(P55)
【作者】张致身
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】R39
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免疫组化SP法与SABC
ABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。
利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。
但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。
SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。
PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。
最大的优点是不受种属的特异性限制。
此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。
两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC 复合物即链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。
SABC步骤：切片常规脱蜡、脱水；30％H2O2＋蒸馏水10份混合，室温5－10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加5％BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，37℃1小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下20分钟，PBS（PH7.2－7.6）洗；滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS洗5分钟×4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中 A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。
显微镜下观察。
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同点只是在于显色基团！SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
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免疫组织化学技术（ABCxx）
大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和
0.03%H
2O
2的
0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH
7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含
0.03%DAB 和
0.006%H
2O
2 的Tris 盐酸缓冲液（pH
7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。
以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。
鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。
A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。
C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。
D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P<
0.01。
比例尺为100 am。
E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P<
0.01。
免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。
荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。
HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。
A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和
B的重叠图像。
箭头示HAP1和NK1R双标细胞。
比例尺为20 am。
细胞进行处理后,弃培养基,用
0.01MPBS漂洗3遍。
加入4%多聚甲醛固定30min。
PBS漂洗3遍。
加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体
(1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次
10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。
激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用
488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。