流式细胞仪检测技术与质量控制
实验七 流式细胞仪检测技术
实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
流式细胞仪SOP
一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER 公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage 和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
2023年流式细胞分析的规范化和标准化
2023 流式细胞分析的标准化和标准化〔全文〕流式细胞分析的临床应用日趋广泛，主要应用有淋巴细胞亚群、造血干细胞计数、白血病免疫表型、阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断、血小板自身抗体及膜糖蛋白检测等，为机体免疫功能评估、血液与淋巴组织肿瘤的诊断、分型、鉴别诊断和预后等供给依据。
随着相关技术的进步和开展，临床使用的流式细胞仪从最初的单激光3 色，已经开展为3 激光10 12 色, 甚至5 激光18 色，一些型流式细胞仪如光谱流式细胞仪更是可以供给至少24 色。
毫无疑问，更多参数流式细胞仪的应用给使用者供给了更多的数据信息，有助于提高疾病的诊疗效率。
流式细胞分析具有强大的用户自定义功能，即不同用户〔试验室〕可依据自己试验目的建立检测流程，从某种程度上讲，流式细胞分析属于试验室自建方法〔laboratory designed test, LDT 〕范畴。
因此，各个试验室操作步骤如染色过程、抗体组合、数据分析等方面都不尽一样。
另一方面, 不同类型的流式细胞仪在激光光源、荧光素种类、抗体克隆、分析软件等的设置也不尽一样。
此外，目前尚未研发出相关工程的标准品。
以上诸多因素导致了流式细胞分析的结果存在较大差异，结果可比性有待提高。
行业内也面临标准化、标准化多参数流式细胞分析这一巨大挑战。
_、标准操作过程流式细胞分析的首要操作是标本处理，这个环节直接影响检测结果全都性和可比性,是标准化至关重要的一环。
具体步骤有标本采集、接收、标本处理。
前 2 个因素的标准化要求在临床试验室标准化协会等多个文件中均已说明。
标本处理通常分为染色和离心2 个步骤,标准地进展标本染色和离心可以确保结果全都性。
(-)标本染色标准化临床实际工作中，标本染色程序依据试验目的进展选择和确认。
选择: 前向散射光(forward scatter, FSC )和侧向散射光(side scatter, SSC ) 的变异系数(coefficient of variation , CV )低；标本中主要细胞亚群的FSC 和SSC 平均通道数要有明显差异细胞损失最小荧光强度保持最高；不影响偶联荧光染料的稳定性；背景染色低；室内误差最小；操作简便快速。
环境检测中微生物检测的质量控制
环境检测中微生物检测的质量控制摘要：随着经济和社会的快速发展，越来越多的安全事故发生，人们开始关心食品卫生问题，国家有关部门也加强了对环境行业的监督管理。
环境安全不仅与人民的身体健康密切相关，还将对企业的生产效率和市场竞争力的提高产生直接的影响，甚至有可能危害到国家经济安全和社会稳定。
所以，做好环境监测监管工作是非常必要的。
目前，国家已经开始对生物危险因素和常见病原菌的监控，以及加强环境微生物检测的品质控制。
关键词：环境检测；微生物检测；质量控制引言微生物如细菌，真菌，病毒等会儿粘附到大气颗粒物上，就会产生生物气溶胶。
在公共场合使用中央空调进行通风时，会把一室的病原细菌传染给另一室，引起机体产生过敏性反应等多种疾病。
类似的，在公众场合使用的公用物件也可能会导致病原体的传播。
在公共场所，若没有经过有效的灭菌，将有可能引起传染病的病菌得以生存和繁衍，从而引起传染病的蔓延。
为降低病原菌感染的危险，防止疾病的蔓延，有必要对公众场所进行常规的细菌的检验。
概述了大气中各种细菌的测定技术及其在空气中的应用，以期对提高空气微生物检测方法及应用进行综述，为完善环境安全提供参考。
一、我国开展微生物检验工作中应强化安全管理（一）一个良好的实验室工作环境能够保证员工的身体和精神上的健康，让员工的情绪变得轻松愉快，从而增强员工对自己工作的认同感，从而更好地促进检测工作的开展。
（二）微生物实验室的安全性与检测结果的可靠度密切相关，高安全性的实验室能够降低其他因素对检测的影响。
比如，微生物检验实验室中常用的压力蒸汽消毒锅和生物安全柜等设备，既可以用于生物安全防护，又可以保证实验室检测结果的准确可靠。
（三）建立具有较高安全水平的微生物检验实验室，能够有效地降低检验过程中出现的各种突发事件的概率，从而有效地降低检验过程中的风险与费用。
二、微生物检测技术概况（一）生化反应鉴定检测技术常规的生物化学识别法虽然识别出的生物标志物具有较高的准确度和可靠性，但其识别过程较费时。
白血病微小残留检测及其质量控制(流式细胞术)
2. 流式细胞术是直接进行定量，更为精确；而PCR是根据 产物的量进行推算。
3. 流式细胞术检测时可以区别活细胞和经化疗将要死亡的 细胞以及死亡细胞的碎片（而这些死亡的细胞以及细胞 碎片在PCR检测中都可能形成阳性信号）。
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Fluorescent Standard
Obtain Results
Troubleshoot Maintenance
Color Compensation
Generate Report
FAIL
Process/ Method Control
PASS
Test Reimbursement
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Elaine Coustan-Smith, etal. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2000, 96(8):2691-2696
流式细胞术检测白血病MRD原理
利用抗原表达的差异，以直观的方式区分白血病 细胞和正常的骨髓细胞（正常生理状态下和骨髓重建期）
跨系表达的抗原 质的差异 时相混乱的抗原 与染色体异常相关的抗原 抗原表达量异常高 量的差异 抗原表达量异常低
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
差异
流式细胞仪产品技术要求2022年
流式细胞仪1范围本标准规定了流式细胞仪的产品分类与命名、要求、试验方法、检验规则、标志与使用说明书、包装、运输与贮存。
本标准适用于流式细胞仪（以下简称产品）。
有特殊要求时按合同执行。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 191-2008 《包装储运图示标志》GB/T 2828.1-2012 《计数抽样检验程序第一部分：按接收质量限（AQL）检索的逐批检验抽样计划》GB 4793.1-2007 《测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第1部分：通用要求》GB 4793.9-2013 《测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第9部分:实验室用分析和其他目的自动和半自动设备的特殊要求》GB/T 18268.1-2010 《测量、控制和实验室用的电设备电磁兼容性要求第1部分：通用要求》GB/T 18268.26-2010 《测量、控制和实验室用的电设备电磁兼容性要求第26部分：特殊要求体外诊断(IVD)医疗设备》YY 0648-2008 《测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第2-101部分：体外诊断（IVD）医用设备的专用要求》GB/T 14710-2009 《医用电器环境要求及试验方法》GB 7247.1-2012 《激光产品的安全第1部分：设备分类、要求》YY/T 0664-2020 《医疗器械软件软件生存周期过程》YY/T 0588-2017 《流式细胞仪》GB/T 9969-2008 《工业产品使用说明书》3分类与命名3.1命名3.1.1产品型号EXFLOW-104 、 EXFLOW-204 、 EXFLOW-206；EXFLOW-104HT、EXFLOW-204HT、EXFLOW-206HT。
3.1.2产品型号划分说明3.2组成结构产品由主机、试剂台和流式细胞仪控制软件（规格型号：EXFLOWSYS）组成。
流式细胞术质量控制
流式细胞术质量控制流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。
由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。
同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。
作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。
在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。
分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。
为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。
它包括质量保证、质量控制和质量评估。
质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。
主要利用质量控制和质量评估。
质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。
对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。
质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。
当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。
因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。
FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。
目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。
2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。
流式细胞仪小结
流式细胞仪技术及专利研究新进展(高金湖无锡荣兴科技有限公司生物化学部)流式细胞术（Flow Cytometer, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
流式细胞仪主要由细胞流动室、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4 部分组成，其工作原理是将被检测对象如细胞等制备成一定浓度的分散的细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入流式细胞仪的样品管中，细胞在气体的压力下进入流动室、流动室由样品管和鞘液管组成，在鞘液的约束下，细胞排列成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞液粒，经特异性荧光染色后的细胞经过激光检测区时受激光激发，产生散射光和荧光信号，通过一些波长选择通透性滤光片，可以将不同波长的散射光和荧光信号区分开来，散射光是从细胞表面或细胞内颗粒散射出来的原激光光谱，其信号比较强，用光敏二级管即可检测。
荧光信号较弱，需用光电倍增管接收并放大，散射光和荧光信号接收后经转换成电信号，这些信号经过加工处理储存于计算机中，用专门的计算机软件对其储存的数据进行图像处理，可在计算机上直观地统计出各种染上荧光染料的细胞的百分率，选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征如细胞大小、DNA 含量、细胞表面抗源表达、癌基因蛋白等等。
市场上销售的流式细胞仪产品种类很多，主要生产厂家有：BD、Beckman-Coulter、Partec、Accuri Cytometers、Guava、Union Biometrica、Amnis等，比较熟悉的还是BD和Beckman Coulter。
各个公司仪器的用法会有所不同，但原理是完全一致的。
BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs(fluorescence activated cell sorter)，即荧光激活细胞分选器。
流式细胞仪技术参数
流式细胞仪技术参数一、工作条件1、环境温度：10-30℃；2、相对湿度：15-80%；3、工作电压：220V.50Hz。
二、技术指标1、激光：488nm蓝色激光器，激光器功率≥50wm。
可升级加配638nm、405nm激光器。
激光器为全固态，持续非脉冲激发。
2、检测参数：前向散射光、侧向散射光、可以实现5色荧光的同时检测；3、光路系统：固定光路系统，不用每天调试；4、荧光检测敏感度：<30分子（FITC）/细胞；5、全峰宽变异系数:CV<3%；6、检测颗粒大小: 至少达到0.5um(min)-50um（max）；7、样本间自动清洗，携带污染率≤1.0%8、有国家SFDA注册证，仪器同厂家计数微球试剂有SFDA 注册证，可用于CD4绝对计数9、分析软件：全套分析软件，能终身免费升级；三、含自动进样器1、可用于流式细胞仪的自动上样系统；2、结合工作站电脑中预装的“工作表管理软件”和“自动进样管理软件”，仪器系统可自动完成数据的收集与分析工作；3、自动进样系统包含一个进样抽屉、电路模块、遥控按键和可容纳32以上个样本管的旋转样本盘。
四、基本配置1、流式细胞仪主机；2、全套分析软件；3、配置电脑：内存≥4 GB，硬盘≥256 GB独立显卡，windows 操作系统，要求与设备相匹配，并可处理存储充足的实验数据；23英寸液晶显示器，附彩色打印机1台；5、进口微量移液器一套（4只）。
6、稳压电源和变压器；血液混匀器一台7、技术资料：仪器全套电路图及中文操作手册、中华人民共和国医疗器械注册证；8、人员培训与技术支持：负责装机与人员培训，享受技术与维修服务。
包修一年，终身保修。
三年内免费调试校准。
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。
该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。
本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。
当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法1.1 标本收集收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。
由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。
本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。
目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
4 讨论流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料介绍流式细胞仪是一种常见的生物学实验仪器，可用于快速分析、定量和分选单个细胞。
它以极高的灵敏性和精度，使其成为现代生命科学中最重要的工具之一。
流式细胞仪的应用范围非常广，包括细胞免疫学、药理学、细胞周期分析、基因表达分析等等。
本文档旨在介绍流式细胞仪的基本工作原理、检测技术和质量控制方法。
工作原理流式细胞仪通过吸收、散射和荧光等特定光学信号来检测和分析细胞。
它的核心组成部分是荧光染料和激发光源，荧光染料可以与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物，激发光源可以激活荧光染料的荧光信号。
当样品通过流式细胞仪时，细胞和细胞复合物被单独地呈现在流体中，并且被一个聚光镜系列扫描，采集特定的光学信号。
通过分析该信号，流式细胞仪可以确定每个单一细胞的荧光特性。
检测技术荧光检测流式细胞仪常用的检测方法是荧光检测。
它需要将荧光染料与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物。
流式细胞仪将样品置于聚光镜下，激发光源激活荧光染料的荧光信号，然后通过聚光镜采集荧光信号。
荧光检测既可以用来鉴定单个表面标记物，也可以用于检测内部标记。
散射检测散射检测是流式细胞仪的另一种找出单个细胞的方式。
散射检测基于细胞对激光束的散射表现，散射强度既可以用来区分不同类型的细胞，也可以用于估计细胞的大小、形状和结构。
生物素-亲合素检测生物素-亲合素检测是流式细胞仪常用的一种检测方法。
生物素-亲合素检测通过不同的化学偶联对荧光染料进行标记，使得检测定量更加精确。
质量控制流式细胞仪的检测结果受多种因素的影响，因此需要严格的质量控制程序来保证检测结果的准确性和可靠性。
质量控制程序包括实验前的设备校准和实验后的数据分析。
设备校准设备校准是流式细胞仪保证检测结果准确性和可靠性的关键。
光学器件需要定期校准，以确保检测的性能和准确性。
每个荧光探针必须进行校准，以确保正确的基线水平和探针强度。
数据分析数据分析是流式细胞仪质量控制的另一关键步骤。
流式细胞仪
H L
A
D
r
CD117
CD38
CD117 CD117
5
Side Scatter
Forward Scatter
DNA Analysis
Forward Scatter Fluorescence
Forward Scatter
FALS
Fluorescence
FLUORESCENCE
Side Scatter
散射光 信号
侧向角散 射(SSC)
不依赖任何细 胞样品的制备 技术
对细胞膜、细胞质、核膜 的折射率敏感，可提供细 胞内精细结构和颗粒性质 的信息
z 信号检测与存贮、显示、分析系统
荧光信号
依赖细胞样品 的制备技术
细胞自发荧光： 细胞自身发出的微弱荧 光信号
细胞标记荧光： 经过特异荧光标记物标 记，受激发照射得到的 荧光信号，对其进行检 测和定量分析可对样品 细胞进行定性、定量分 析。
流式细胞仪（Flow Cytometer)
流式细胞仪是一种新型高科技仪器，涉及的技术有： 激光技术、流体力学技术、电子物理技术、光电测量 技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗 体技术等。
应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞 或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的 技术称为流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）。
荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量， 主要用于对DNA倍体测量。
z 荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA的含量。
z 当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞得 到的荧光脉冲高度不等时，对荧光信号积分后， 所得到的信号值相等。
荧光信号的宽度：用于区分双连体细胞。
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流式细胞仪检测技术与质量控制
【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。
流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。
【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制
流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。
该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。
本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。
当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。
由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。
本方法灵敏度非常高，
在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。
目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
4 讨论
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。
原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。
在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对于只作胞内染色的样本，根据待
分析细胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。
流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性等[2]。
仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞仪质控中的一种常用的标准品。
精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。
但细胞周期和倍体分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小于2%。
灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数（MESF）法。
该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球组成（包括未标记荧光的空白微球），表明该微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪灵敏度的回归曲线，回归曲线与Y轴的交点即为该机的灵
敏度，或叫做最低检测限度[3]。
准确度及其校准流式细胞仪的准确度同精密度和灵敏度相比不很重要，但随着定量流式细胞技术的发展和荧光定量分析在实际工作中的需求越来越大，流式细胞仪准确度的评价和质控品也开始受到重视，在样品中加入内标或某些生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞，可对仪器准确度进行有效监测。
当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过调整荧光补偿，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果的可靠性。
荧光补偿是流式细胞术多色分析前必须进行的仪器校准，通常采用每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色，来进行仪器补偿调整，也可以通过商品化荧光补偿试剂进行。
当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，Levey-Jennings质控图是目前在临床检验质量控制中使用较多的方法，根据Levey-Jennings质控图的评价要点来观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。
室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，自2000年以来，我国由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评工作，现已开展的项目包括T细胞亚群分析
和CD34绝对计数。
【参考文献】
[1] 崔巍，牛福玲，何丽云，王硕仁.流式细胞术检测细胞凋亡的分析软件比较.北京中医药大学学报.2001.（6）45-47
[2] 陶德定；冷彦；覃吉超；余源；龚建平.新鲜肿瘤标本活细胞与固定细胞的DNA含量分析比较.癌症：英文版.200120（5）：502-504
[3] 曾文军，王柳均，樊翌明，吴志华.细胞凋亡的流式细胞仪检测技术研究进展[J].医学文选.2005.24（3）：425-426。