DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li
DPPH自由基清除法
100
DPPH Inhibition %
Trolox BHT Maቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnolol
80 60 40 20 0 0.000 0.004 0.008 0.012 0.016 Concentration mg/mL 0.020
A
NO2
方法大致与 1.4 相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行 数据后，都要重测一次 A0. [实验结果] 清除率（抑制率）的计算公式：
A A Inhibition % = 0 A0
100%
[实例]厚朴酚magnolol的DPPH清除率曲线：(图中Trolox和BHT为阳性对照组)
O2N N N O2N
当 DPPH 自由基被清除，其最大吸收波长 519nm 处的吸光度 A 值随之减小。DPPH 这种稳定的自由基 为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH 测试液的配制 取 DPPH 1mg 溶于约 20mL 溶剂（乙醇、95 乙醇或甲醇）中，超声 5min，充分振摇，务使上下各部分 均匀。取 1mL 该 DPPH 溶液，在 519nm 处测 A 值，使 A＝1.2-1.3 之间最佳。该 DPPH 溶液最好避光保存， 3.5 小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成 1mg/mL 浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选 95 乙醇或无水乙醇，如不溶可用 DMSO。 1.3 预试 取 DPPH 溶液 2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色 情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置 5 个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到 200μL 时，DPPH 溶液颜色基本褪去，则 100μL 为该样品液的最 大用量。其用量梯度宜设为 40、80、 120 、160、200μL。 1.4 测量 A0 值的测量：取 DPPH 溶液 2 mL 加入到小试管（或玻璃瓶）中，加 95 乙醇（或无水乙醇）1mL，充 分混合，测 A 值（519nm），此 A 值为 A0（A0 多在 0.7-0.9 之间）。 A 值的测量：取 DPPH 溶液 2mL 加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液 xμL （x 是根据 1.3 预试 结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95 乙醇（或无水乙醇），混合，静置 30 分钟后，测 A 值 （519nm）。如：某样品的用量梯度为 40、80、 120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 样品液 40μL 80μL 1200μL 160μL 200μL 1.5 正式测量 95乙醇（或无水乙醇） 960μL 920μL 880μL 840μL 800μL 加样表 DPPH测试液 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 总体积 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL
DPPH自由基清除法实验以香草酸为例
DPPH自由基清除法实验—以香草酸为例【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿。
2.试剂香草酸（AR）、DPPH（AR）、无水乙醇（AR）；【原理】根据文献[1]可知，DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，它的分子中，由于存在多个吸电子的硝基-NO2和苯环的大π键，所以能稳定存在。
所以DPPH作为体外的一种非常稳定的自由基，常被用于检测物质清除自由基能力。
其原理是它在波长519nm处有最大吸收，显紫色，当自由基被清除后，其溶液吸收会减少，紫色会变浅。
通过计算其吸收度减少幅度，可得到自由基清除率，用以判断物质的自由基清除能力。
图1.DPPH结构式图 2.DPPH分子模型【实验对象】香草酸（Vanillic acid），学名“4-羟基-3-甲氧基苯甲酸”，分子式为C8H8O4，是酪氨酸、儿茶酚胺的代谢产物，主要以硫酸酯结合型存在于尿中。
香草酸为白蒿的抗菌主要有效成分，广泛存在于胡黄连、高丽参等中药材中，具有抗细菌和抗真菌的作用。
香草酸具有较强的抗氧化活性，是良好的混合型酪氨酸酶抑制剂。
香草酸在结构上咖啡酸、阿魏酸极其相似，它们三者之间又可以作为彼此的代谢物而存在于体内，具有较高的研究意义。
图3.香草酸结构式图4.香草酸分子模型【实验操作】清除DPPH能力检测本实验采用文献[1]的方法，并视情况改动。
大致过程如下：1. DPPH测试液的配置取DPPH 0.5mg溶于约20mL溶剂（无水乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A 在0.9左右。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
A清除自由基实验方法
1、DPPH 自由基清除实验取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。
同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。
4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。
自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。
2、ABTS 自由基清除实验20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。
该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。
加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。
ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。
ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。
3、超氧阴离子清除实验采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。
在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
DPPH和ABTS法测定核桃仁的体外抗氧化活性
DPPH和ABTS法测定核桃仁的体外抗氧化活性邱金东;汤昆【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2008(030)008【摘要】核桃（Juglans regial）是胡桃科核桃属多年生落叶乔木，学名胡桃，在我国栽培历史悠久，分布很广，资源十分丰富。
核桃仁药用价值很高，具有补肾固精，敛肺定喘、镇咳、补脑、延缓衰老等作用。
本试验用DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法来研究核桃仁的体外抗氧化活性。
这两种方法都是基于分光光度法来测定样品的抗氧化活性，与其他抗氧化方法相比，操作简单、快速，在国内外有着广泛的应用。
国内对核桃的研究虽然多，但对核桃仁的抗氧化活性研究不多。
孟洁等人用DPPH方法测定了核桃仁的抗氧化活性，但并未明确各提取物的半数抑制率。
【总页数】2页(P1215-1216)【作者】邱金东;汤昆【作者单位】河南大学药学院,河南,开封,475004;河南大学医学院,河南,开封,475004【正文语种】中文【中图分类】R285.6【相关文献】1.DPPH法测定金丝梅体外抗氧化活性 [J], 段静雨;李岩;王健慧;杨佳;陆文虎;余纯旺;纪传宝2.Antitumor and Antioxidant Activities of the New Anthraquinone Derivatives: Synthesis,DPPH, ABTS, Biological and DFT Investigations [J], SIYAMAK Shahab; MASOOME Sheikhi; RADWAN Alnajjar; LIUDMILA Filippovich; EVGENIJ Dikusar3.ABTS法和DPPH法测定类胡萝卜素清除自由基能力的适用性 [J], 羌宇; 张耀宗; 余勃; 陆豫4.基于DPPH、ABTS法的竹叶花椒抗氧化谱效关系研究 [J], 赵容; 张萌萌; 陈茜; 王丹; 袁星5.DPPH、ABTS和FRAP微量法测定山奈酚的抗氧化能力 [J], 王荣;罗倩;冯怡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican Li
dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-
Xican Li
dpph自由基清除实验:实验流程图2017.10
【前言】DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在519 nm范围有最大吸收峰。
其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个成单电子。
NO2
NOON22
NH
.N
DPPH自由基结构式 DPPH自由基模型图
当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H分子，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析。
清除DPPH自由基是DPPH法的根据，当DPPH自由基与抗氧化剂反应后，519nm波长处的吸收值降低，其降低的程度与接收的电子(抗氧化剂清除自由基活性)呈定量关系，反应进程很容易通过分光光度计测定。
【文献】Jing Lin, Xican Li, Li Chen, Weizhao Lu, Xianwen Chen, Lu Han, Dongfeng Chen. Protective effect against hydroxyl radical-induced DNA damage and antioxidant mechanism of
[6]-gingerol: A Chemical Study. Bulletin of the Korean Chemical Society, 2014, 35(6), 1633-1638.
【实验流程图】
1
2。
DPPH自由基清除实验教学(详细版)
DPPH实验步骤一、原理：DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。
作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获("清除")其他的自由基。
因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。
由于DPPH自由基在以520nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。
有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。
此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。
二、实验步骤：1.配制0.1mM的DPPH溶液：配两次，每次取0.002gDPPH溶于50mL乙醇，避光保存。
2.配制0.5mg/mL的Vc溶液，至少2mL（设为阳性对照，选择性做）3.配制一定浓度的样品溶液，至少2mL母液（也可以配制不同溶度梯度样品，计算IC50）4.上板（避光操作，上完板后，室温避光30分钟，测吸光度）96孔板，三组，每组设3个复孔，每孔加入量及96孔板分布如下：sample（样品组）：样品溶液100uL+ DPPH醇溶液100uL (每个浓度3个孔)blank（空白组）：样品溶液100uL+无水乙醇100uL （每个浓度3个孔）control（对照组）：DPPH 醇溶液100uL+水100uL （一块板可共用一个对照组,3个孔）样品VC浓度 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 sampleblankcontrol5.检测并计算清除率测517nm处的吸光度，取平均値，计算每个浓度的DPPH清除率，做出折线图。
硒杂环化合物SPO清除DPPH和ABTS自由基的光谱学研究
２ 结果 与讨论
ｂ ｎ ｏ ｈａｏ ｉ－一 ｕｆｎ ｃａ ｉ ，Ｔｒ ｌｘ（ － ｙ ｒｘ － ５ ７ ８ ｅ ｚ ｔ ｉｚ ｌ ６ ｓ ｌｏ ｉ ｃｄ） ｎ ｏｏ ６ ｈ ｄ ｏ ｙ２， ， ， 一
＼ ／．
２Ｉ Ｄ Ｐ 和 Ａ Ｔ ． Ｐ Ｈ Ｂ Ｓ反 应 体 系 的 吸 收 光 谱 及 测 定 波 长 的确
１４ Ａ Ｔ ． Ｂ Ｓ自由 基 清 除 实 验
４０ ０
５ ０ ０
６０ ０
７０ ０
８０ ０
Ｗ ａ ｅｈ ｅ ｇ ｈ ｎ ｖ ｔ Ｉｎ ｌ ／ ｍ
Ｆｉ． Ａｂ ｏ ｐ ｉ ｎ ｓ ｅ ｔａ ｏｆＤＰＰＨ ，ＡＢＴＳ ａ ＰＯ ｇ２ ｓ ｒ ｔｏ ｐ ｃ ｒ ｎｄ Ｓ
５ Ｌ不 同浓 度 的样 品 或 参 比溶 液 （ ＭＳ ， 加 入 ３ｎ ６ Ｏ“ Ｄ Ｏ） 再 也 Ｏ ｍ０ ． 的 Ｄ Ｐ 甲 醇 溶 液 ，振 荡 摇 匀 ，于 室 温 下 避 光 静 １Ｌ ＰＨ
０
置 ３ ｎ ０ｍｉ，然 后 测定 溶 液在 ５ ５ｎｎ处 的吸 光 值 ，并 扫 描 １ ｒ Ｕｖ＿ ｓ ｖｉ光谱 。 Ｄ Ｐ 自由基清除率 （Ｘ） １ ＰＨ Ｉ 一（ 一ＡｓＡｏ ×１０ ， 中 ／ ） ０ 其 Ａ ｓ为样 品管的吸光值 ； 为对照管 的吸光值 。 Ａｏ
ａ：ＡＢＴＳ；ｂ：ＤＰＰＨ ；ｆ ＰＯ ：Ｓ
参照文献［ ６ 方 法 。用 ｐ ． １］ Ｈ ７ ４的 Ｐ Ｓ配制 ５ｒｍｏ ・ Ｂ ｎ ｌ
Ｌ１ Ａ Ｔ ＿ 的 Ｂ Ｓ储 液 ，与 Ｍｎ ２反 应 后 用 ０ ２ ｍ 的 Ｐ ＤＦ膜 Ｏ ． Ｖ 过 滤 ， 用 Ｐ Ｓ ｐ ． ） 释 到 ７ ４Ｄ ｔ 吸 光 度 为 ０ ７ － 再 Ｂ （Ｈ ７４稀 ３ Ａ 处 ｆ ． ０４ ＿ －
PTIO和ABTS自由基清除实验操作指南-李熙灿 曾婧媛
PTIO和ABTS自由基的清除实验操作指南（以槲皮素为例）【前言】PTIO和ABTS自由基简介PTIO是与人体内自由基较为相似的氧自由基;而ABTS是氮自由基，虽然主要元素不同，但它们都较为稳定且随着被清除都会造成在特定波长下吸光度减小，所以常被用于检测物质体外抗氧化能力强弱。
本文详细介绍了这两种自由基清除实验的操作方法，并附有实例。
其中，PTIO自由基可以用于检测活性氧的清除能力；而ABTS自由基则适于检测活性氮的的清除能力。
（A）（B）（C）（D）图1.（A）PTIO•自由基结构式（B）ABTS•自由基结构式（C）PTIO分子模型（不同角度）（D）ABTS分子模型（不同角度）（采用Chem3D Pro 14.0软件绘制）【实验方法】1. PTIO自由基清除[1]1.1 溶液的配置PTIO试液：3mg PTIO固体+20mL 甲醇超声，混匀PTIO测试液取80μL PTIO测试液和20μL甲醇（与PTIO测试液中溶剂一致）混匀，在557nm 处测定吸光度，使吸光度保持在0.35±0.01之间。
吸光度偏大或偏小，就调节原PTIO测试液的浓度，使吸光度保持为0.35±0.01。
此吸光度为A0。
样品液：用合适溶剂溶解（一般为95乙醇或水），先配置成10mg/mL的溶液，可适当超声使之完全溶解，混合均匀。
1.2 预实验取80μL的PTIO试液，往其中加少量样品液，加样时，缓慢少量加入，边加边混合，并观察溶液褪色情况，当溶液刚刚好褪色完全，记下此时样品的加样量。
此加样量即为样品最大加样量，在此最大用量基础上，往前设置5个用量使之成为等差数列。
（如，如果最大加样量为20μL，那么对于该样品而言，其用量梯度宜设为0μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL）注意事项：预实验中可能会遇到样品最大加样量很小（低于10μL），此时应该降低原样品液的浓度，再做预实验。
如果最大加样量低于10μL，可能不会得到很好的量效关系曲线。
DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基的能力
DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基的能力李春阳;许时婴;王璋【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2006(025)002【摘要】通过DPPH法测定葡萄籽原花青素抗氧化、清除自由基能力,实验表明:随着葡萄籽原花青素纯化程度的提高,其抗氧化、清除自由基的能力也相应地提高.葡萄籽原花青素纯化物的抗氧化、清除自由基能力大于VC和芦丁,葡萄籽粗提物的抗氧化、清除自由基能力略低于VC,但高于芦丁.GSP、GSPP1、GSPP2、GSPP3、GSPP3-SP、VC、芦丁清除DPPH自由基的半抑制量分别为118,93,88,86,63,110,170 g/kg,其自由基清除能力AE分别为0.84×10-2、1.08×10-2、1.14×10-2、1.16×10-2、1.58×10-2、0.59×10-2、0.59×10-2.【总页数】5页(P102-106)【作者】李春阳;许时婴;王璋【作者单位】江南大学,食品学院,江苏,无锡,214036;江苏省农业科学院,农产品加工研究所,江苏,南京,210014;江南大学,食品学院,江苏,无锡,214036;江南大学,食品学院,江苏,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】S663.1【相关文献】1.DPPH法测定龙眼叶丙酮提取物的自由基清除能力 [J], 李培源;彭炳华;莫媛媛;霍丽妮;秦一兰2.DPPH法测定树上虾丙酮部位自由基清除能力 [J], 李培源;霍丽妮;彭炳华;莫媛媛;秦一兰;黄晓东3.DPPH法测定自制蜂王幼虫美白、抗衰老防皱面霜清除DPPH自由基的能力 [J], 谭曜; 陈平; 许赛慧; 朱杰4.ABTS法和DPPH法测定类胡萝卜素清除自由基能力的适用性 [J], 羌宇; 张耀宗; 余勃; 陆豫5.DPPH法测定莲蓬原花青素清除自由基能力研究 [J], 吴佳红;王建美;姚周平;葛彬洁;林小柯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
abts法和dpph法测定类胡萝卜素清除自由基能力的适用性
系在 １８０ mi
n 内保持稳定.７ 种类胡萝卜素在 ７３４nm 处吸光值随样品浓度的增加而降低,具有显著量效关系. 经
测定获得了 ７ 种类胡萝卜素与槲皮素清除 ABTS 自由 基 的 半 数 抑 制 浓 度 (
一.本实验对常用的两种清除自由基活性的测 定 方 法,
DPPH 和 ABTS 法,进 行 了 类 胡 萝 卜 素 适 用 性 的 研 究. 采
用 ７ 种类胡萝卜素与槲皮素作为研究对象,分别考察 了 其 清 除 DPPH 和 ABTS 自 由 基 的 能 力 及 其 光 谱 学 特 征,并
优化活性测定条件.结果 表 明,采 用 DPPH 测 定 法 时,部 分 有 色 类 胡 萝 卜 素 由 于 其 最 大 吸 收 峰 在 ４５０~５５０nm 之
Ｇ胡 萝 卜 素 ＞ 番 茄
红素.ABTS 清除实验避免了有色抗氧化剂本身的光 谱 干 扰,相 比 DPPH 自 由 基 清 除 测 定 而 言,更 可 靠、方 便,更
适合作为类胡萝卜素清除自由基性测定方法之一.
关键词:类胡萝卜素;
DPPH;
ABTS;自由基清除能力
中图分类号:
O６５ 文献标志码:
A
App
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ABTS自由基清除法SOP
主要目的：
——为了测定样品清除ABTS自由基的能力。
主要原理：
——用K2S2O8与ABTS 直接生成稳定的阳离子自由基ABTS+，抗氧化物质与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。
实验室签章
一、试剂
——K2S2O8水溶液
——ABTA溶液
——乙醇（分析纯）
——PBS 溶液
二、仪器设备
——96孔酶标板
——UV-Vis可见多功能酶标仪——移液枪
——200 µL量程枪头
三、实验方法
◆前期准备
ABTS储备液（7.4 mmol/L）取ABTS 96 mg，加蒸馏水25 mL。
K2S2O8储备液（2.6 mmol/L）取K2S2O8 378.4 mg，加蒸馏水10 mL。
将5 ml 7.4 mmol/L ABTS储备液与88 µL 2.6 mmoL/L K2S2O8混匀，静置12-16小时，配制成ABTS工作液。
◆ABTS自由基清除法
0.4 mL ABTS工作液，用PBS 溶液稀释，要求在常温下734nm 处吸光值为0.7±0.02。
0.2 mL ABTS+·工作液与10uL 不同浓度受试物混合，常温避光静置6min，在734 nm 波长处测吸光度，平行3次。
ABTS自由基清除能力由下式计算：
清除率（%）=[A0-A i/A0]×100%
式中：A0为不加样品，加入ABTS 的吸光度；A i为加入样品和ABTS 的吸光度。
常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li
常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。
当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。
实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。
该DPPH溶液避光保存，4h内用完。
（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li
DPPH和ABTS、PTIO⾃由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-LiDPPH?和ABTS+?⾃由基清除实验（含PTIO?⾃由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（⼴州中医药⼤学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考⽂献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?⾃由基三者，都是常⽤的⾃由基。
概述如下表：⼯作液外观紫⾊墨绿⾊蓝紫⾊⼯作液紫外光谱与最⼤吸收2004006008000.00.51.01.52.02.53.0吸光度波长/nm519nm(50 µg/mL)2003004005006007008009000.00.51.01.52.0734nm吸光度波长/nm415nm（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）2004006008002吸光度波长/nm557nm(50 µg/mL)检测波长 519 nm 734nm557nm （⽔溶液）检测原理当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。
新版ABTS自由基清除实验-实验流程图-ABTS溶液配制方法-操作图解-李熙
ABTS自由基清除/PTIO自由基清除实验：实验流程图2018.4（含ABTS自由基配制方法）图1 ABTS自由基清除实验和PTIO自由基清除实验的流程图【说明】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS，Reactive oxygen species）和活性氮（RNS，Reactive nitrogen species）。
ROS主要有羟基自由基·OH，过氧自由基(·O2-)，脂质过氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。
这些ROS和RNS如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。
许多药用植物的提取物，能清除ROS和RNS。
这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。
上述提到的RNS 和ROS其实，都是不稳定的（如·OH，·O2-， LOO·，·NO），很难直接用于抗氧化评价实验。
ABTS自由基清除法是最常见的用于评价药用植物或纯化合物的抗氧化活性的一种方法，因为，ABTS+·自由基较稳定，稳定的ABTS+·自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在734 nm范围有最大吸收峰。
当向ABTS 自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对， ABTS自由基溶液褪色，734nm波长处的吸收值降低，可以用分光光度计测定。
ABTS自由基之所以稳定，由于N原子上那个成单电子，可以与苯环形成p-π共轭。
ABTS +·自由基(亦称ABTS +·自由基离子)，并不是一个现成的试剂。
只能通过粉末状ABTS 二铵盐，将其氧化，才能得到ABTS +·自由基。
其反应可表示如下：图2 ABTS 二铵盐被氧化成ABTS +·自由基清除的反应式从结构式中可以看也，其成单电子位于N 原子上，所以，是RNS 而不是ROS 。
所以， 严格讲，ABTS 法只能用于评价RNS 清除水平而不是ROS 清除水平。
DPPH氮自由基清除能力测试试剂盒酶标板法
DPPH氮自由基清除能力测试试剂盒酶标板法氮自由基（DPPH）清除能力测试试剂盒---酶标板法一、测定原理DPPH自由基是一种较稳定的含氮自由基，有一个单电子，在517nm下有强吸收，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收会消失褪色，褪色程度与接受电子的量呈正比。
即反应物清除氮自由基的能力与试剂在517nm的吸光值成反比。
二、试剂组成试剂一：DPPH试剂100μL支试剂二：100μg/mL 维生素C标准溶液 1ml×1支三、储存条件及有效期试剂盒-20℃可保存6个月。
四、试剂的配制试剂一：37℃平衡20min以上，待试剂融化后，在试剂瓶中加入10ml 95%乙醇或无水乙醇，剧烈震荡使试剂充分溶解。
注意：溶解一定要充分，如有条件可采用超声波助溶。
试剂二应用液：根据是否需要制作阳性对照标准曲线有两种配制方法。
1. 如仅需要将维生素C作为质控品，可取100μL 试剂二，加入900μL样品稀释液，充分混匀，配制成10μg/mL 维生素C；2. 如需测定维生素C的IC50，可分别移取0，2，5，10，15，20，25，30，40，50μL 试剂二于空离心管中，再依次加入100，98，95，90，85，80，75，70，60，50 μL样品稀释液，充分混匀。
配制成0，2，5，10，15，25，30，40，50 μg/mL 维生素C样品。
五、操作步骤空白孔1测定孔对照孔2质控孔试剂一（μL）1001000100样品溶液（μL）100100试剂二应用液（μL）100样品稀释液（μL）100充分混匀，室温避光静置30min使之充分反应。
517nm处采用酶标仪测定吸光值。
1空白管很重要，建议做3个以上平行；2如样品颜色较浅可不做对照管六、计算公式注：1 如未做对照孔，可以将其视作为0；2 质控孔求值时将其视作测定孔进行计算即可。
七、注意事项1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的氮自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。
羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法
羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解（适用于各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxylradical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088.操作图解图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图具体方法1 溶液配制0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。
0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。
磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。
Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。
FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。
抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。
H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。
脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。
三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。
硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。
样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。
dpph自由基清除原理
dpph自由基清除原理
DPPH自由基清除原理是一种常用的方法，用于评估物质的抗
氧化能力。
DPPH（2,2-二苯基-1-苦味酮肼）是一种紫色自由基，具有不配对电子，可吸收紫外-可见光谱范围内的光线，
发生颜色褪变。
在清除DPPH自由基的过程中，如果物质具
有清除能力，会导致DPPH的颜色变浅，光吸收减弱。
DPPH自由基清除实验可通过光度计来测定。
在实验中，首先
将DPPH固体溶解在适当溶剂中，形成浓度适中的溶液。
随后，向DPPH溶液中加入测试物质。
当测试物质呈现清除DPPH自由基的能力时，DPPH的颜色由紫色逐渐变浅，光吸
收度下降。
DPPH自由基能被多种物质清除，包括天然产物如多酚类和类
黄酮等化合物，以及合成抗氧化剂（例如BHA和BHT）。
这
些物质中含有高的氢供体能力，能将自己的氢原子转移给DPPH自由基，从而中和DPPH的不配对电子。
DPPH自由基清除实验可以定量测定物质的抗氧化能力，常用
抗氧化指标包括DPPH清除率和半数清除浓度（IC50）。
DPPH清除率表示物质清除DPPH自由基的能力，清除率越高，抗氧化能力越强。
IC50值表示使DPPH清除率达到50%所需
的物质浓度，值越低，抗氧化能力越强。
总之，DPPH自由基清除实验是一种简便、快速、可靠的评估
物质抗氧化能力的方法，可用于筛选和比较不同物质的抗氧化活性。
DPPH自由基清除与普用自由基清除实验(水溶液)-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican-Li (1)
水溶液中“普用”自由基清除的实验实验操作图2019.6 【参考文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PT IO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.【简介】“普用”自由基，原名是PTIO自由基。
它是一种能溶于水的自由基，所以，可以在水溶液中进行自由基的清除实验。
这比DPPH自由基清除实验，更合理；因为DPPH 自由基清除只能是有机溶剂（如乙醇、甲醇）中进行。
另外，“普用”自由基是以氧原子以中心的自由基，而DPPH自由基是以氮原子为中心的自由基。
所以，“普用”自由基的清除能更好地反映出ROS的清除水平。
更进一步地，“普用”自由基清除也可以在缓冲液中进行。
在pH 4.5缓冲液中，“普用”自由基清除是电子转移（Electron-transfer, ET）机制。
在pH 7.4缓冲液中，如果样口也能清除“普用”自由基清，表明在pH 7.4的生理水溶液下，样品也有抗氧化活性。
如果pH 在pH4.5和pH7.4各溶液中，样品的清除能力不同，表明pH值影响了其抗氧化行为。
由于pH值表征了质子（H+），所以，这差异也表明，样品的抗氧化行为与质子转移(Proton transfer, PT)有关。
所以，一个样品如果在pH 4.5和pH 7.4缓冲液表现不同的IC50值，就提示：样品的抗氧化机制是ET + PT。
总之，“普用”自由基清除的实验即可以用于评价抗氧化活性的强弱（水溶液中），还可以探讨抗氧化机制。
1. 样品溶液配制（1）抗氧化活性评价：宜用蒸馏水作溶剂。
如果蒸馏水不溶，则用醇亦可。
浓度视样品溶解性而定，但宜尽量配浓。
ABTS测抗氧化性原理-具体操作-以椴树苷为例-李熙灿 曾婧媛
ABTS测抗氧化性原理及其具体操作（以椴树苷为例）李熙灿曾婧媛【原理】ABTS法是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法。
ABTS与K2S2O8反应可以生成稳定的自由基ABTS+•，此自由基在734nm下有最大吸收且会显蓝绿色，当自由基被清除，数量减少其溶液颜色会变浅，从而导致734nm下吸光度降低。
由此可以来判断样品清除ABTS+•的能力。
图1.ABTS自由基结构式图2. ABTS分子模型（不同角度）（采用Chem3D Pro 14.0软件绘制）【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿；pH计。
2.试剂椴树苷（AR）、BHA和Trolox（AR）；甲醇（AR）；无水乙醇（AR）；ABTS（AR）；K2S2O8（AR）【试验操作】图3. 椴树苷结构式图4. 椴树苷分子模型（不同角度）（采用Chem3D Pro 14.0软件绘制）清除ABTS+·自由基检测实验采用文献[1]的方法，并根据实际情况改动。
操作如下：1 配制溶液[1]取7.4mmol/L ABTS储备液和2.6mmol/L K2S2O8储备液各1mL等体积混合，于室温、避光条件下放置12小时，即得ABTS+·自由基储备液。
先用无水乙醇稀释ABTS+·工作液，使其在734nm波长下的A（吸光度）至0.701（A=0.7±0.02，温度30℃）。
2 实验操作及测定[1]用移液器精确移取ABTS+·工作液800μL、加椴树苷（1mg/mL，无水乙醇溶解）xμL（x=40、70、100、130、160）、无水乙醇（200－x）μL于洁净的试管中，反应体系总体积1000μL，振摇10s、充分混合，静置6min，测定A734nm值。
实验平行检测三次。
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DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxid e (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。
概述如下表：12工作液外观紫色墨绿色蓝紫色工作液紫外光谱与最大吸收2004006008000.00.51.01.52.02.53.0吸光度波长/nm519nm(50 μg/mL)2003004005006007008009000.00.51.01.52.0734nm吸光度波长/nm415nm（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）200400600800012吸光度波长/nm557nm(50 μg/mL)检测波长 519 nm 734nm557nm （水溶液）检测原理当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。
其清除机制主要是氢转移HAT (hydrogen atom transfer) 当A 734nm 值减少，表明ABTS·+被清除。
其清除机制主要是电子转移ET (el ectron transfer)当A 557减少，表明ABTS·+被清除。
其清除机制主要是电子移ET (electron transfer)加质子转移PT (proton transfer)用途主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。
主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。
主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。
通过调节缓冲液的pH 值，可以检测其抗氧化机制。
优势清除速度较快，约30分钟（室温下）。
清除速度较快，约6分钟（室温下）。
（1）水溶性好，与生物相关性强；（2）是氧自由基，能更好地表往ROS 清除水平；（3）抗氧化机制明确：pH 值小于5.0时，为电子转移ET 机制。
当调节pH 值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH 值有关，也就是说与氢离子（质子）浓3【实验讲解】1.DPPH•自由基清除实验[1]1.1 DPPH测试液的配置取DPPH固体1mg溶于24mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
最好避光保存，5小时内用完。
取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。
若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。
1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。
1.3 预试取DPPH溶液1.0 mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。
加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到500 μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500 μL为该样品液的最大用量。
则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL。
A0值：取DPPH溶液1.0 mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5 mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。
A值：取（500-x）μL 有机溶剂到比色皿中，加样品液x μL （x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0 mL，混合使反应液总体积为1.5 mL。
测A值。
【如】某样品的用量梯度为100 μL、200 μL、300 μL 、400 μL、500 μL，则加样如下：样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积0μL 100μL 500 μL400 μL1.0 mL1.0 mL1.5 mL1.5 mL200μL300 μL 1.0 mL 1.5 mL 300μL200 μL 1.0 mL 1.5 mL 400μL100 μL 1.0 mL 1.5 mL 500μL0 μL 1.0 mL 1.5 mL 1.4 最终测量每测一个用量需要测三个平行数据。
1.5 DPPH•清除率（抑制率）的计算4500=100A AA -⨯清除率%(A 0为不加样品时的值；A 为加入样品后的值。
)1.6 使用注意事项 1.6.1 测量前，要先用空白溶剂调零。
1.6.2 将溶液注入比色皿后应当充分摇匀，使颜色均匀分布。
1.6.3 每次使用前后要注意比色皿的清洁。
1.6.4 如果在实验过程中出现A 值大于A 0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致，此时，应该减去本底吸收的A 值(A 本)。
这个A 本值可以通过，加样品但不加DPPH 的方法测得。
此时的计算公式为：00()=100A A A A --⨯本清除率%1.7 疑难解答问：DPPH 实验测量抗氧化性的原理是什么？答：DPPH 法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。
此法是根据DPPH 自由基有单电子，在519nm 处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。
当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，溶液颜色减淡，其褪色程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。
问：DPPH 自由基被清除的机制是什么？答：DPPH 自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT ），简要过程如下（以1,3,5,8-四羟基氧杂蒽酮为例）：问：实验中的溶剂应该怎么确定？答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。
值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。
另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。
问：样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？答：不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数值，实验中要根据预试结果进行调整。
由于1 mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。
另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。
问：测量完成后怎么计算IC50答：IC50值是指清除50%的自由基，所需要的样品的最终浓度。
有两种计算方法。
第一，以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。
将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值，注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。
第二，通过浓度曲线的图直接读出。
在50%处画一横线，此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标，即IC50.另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。
问：为什么要用Trolox作为阳性对照？答：维生素E（生育酚）是常见的抗氧化剂。
不过，维生素E难溶于水，而且易变质。
为此，化学家将其结构进行修饰，即得Trolox（化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。
Trolox不仅溶于水，而且易溶于有机溶剂，所以，广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。
亦称水溶性维生素E。
为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力，通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。
另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。
问：为什么会出现清除率为负值的情况？答：样品的活性太弱，所以，加入的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话，就会产生一个可观的A值，导致A>A0,清除率为负。
问：DPPH•清除率会大于100%吗？答：不可能。
1.8实例茶黄素清除DPPH•67量效曲线图(Microcal Origin 绘制)：D P P H 清除率 %最终浓度 μg/mL82. ABTS·+自由基清除实验[2] 2.1 溶液配制 2.1.1 ABTS 二铵盐储备液(7.4 mmol/L)：取ABTS 二铵盐 3 mg ，加蒸馏水0.735mL 。
（MW ＝548.7） 2.1.2 过二硫酸钾（K 2S 2O 8）储备液(2.6 mmol/L)：取K 2S 2O 8 1mg ，加蒸馏水1.43 mL 。
（MW ＝270.32） 2.1.3 取0.2mL ABTS 二铵盐储备液和0.2mL K 2S 2O 8储备液混合，黑暗环境下室温放置12小时，用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸 光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS •+自由基工作液。
（注：也可以用95乙醇或无水乙醇，但必须是原装分析纯试剂，回收或重蒸者均不可用。
） 2.2 样品液的配置 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1 mg/mL 浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO 。
2.3 预试 取ABTS•+自由基工作液0.8 mL ，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。