蛋白质晶体结晶技术

结晶剂
• 对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂水的影 响而非对蛋白质分子的影响。一般来讲，结晶剂主要分为 6 类： • ①盐类，如：磷酸盐、硫酸铵等； • ②高分子直链聚合物，如：聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、 聚乙烯吡咯烷酮PVP 等； • ③小分子多元醇MPD 类，如：2-甲基2,4-戊二醇； • ④有机溶剂类，如：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇 等； • ⑤磺酰类染料； • ⑥去离子水。在实际工作中，通常使用混合结晶剂以获得 更好的实验效果。
• 蛋白质结晶的基本方法
• 结晶的方法分3 种：批量结晶、蒸发扩散结 晶、液/液扩散结晶。
• ①批量结晶。批量结晶是最古老和最简单 的蛋白质结晶方法。它将所要结晶的蛋白 质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时， 就混合起来以达到所要的过饱和度。实验 样液的体积在50 μL～几个毫升左右。 由于批量结晶的样液体积较大，所以此法 并不适于对最佳结晶条件的探索实验。一 种改进的方法叫微量分批结晶技术。
• ③温度。温度的变化会引起蛋白质溶解度 的改变。研究表明，大多数的蛋白质的结 晶是在4～22 ℃温度范围内进行。某些蛋白 质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高， 而在聚乙二醇及甲基丙二醇 溶剂中的溶解 度随温度降低而降低。
• ④pH 值。蛋白质为两性物质，结晶体系pH 值的变化对其结晶行为有着重要的影响。 对于有些蛋白质分子如：E.coli 的闭环腺苷 酸激酶，如果不考虑所得晶体的晶型，则 结晶可在较宽的pH 值范围内进行，但是如 果涉及特定的晶型，则对pH 值的要求非常 严格，通常其波动范围不超过1。一般来讲， 越靠近最佳pH 值，晶型越单一，所得晶体 质量越高。
• ②蒸发扩散结晶。摸索蛋白质结晶条件最 常用的方法是应用蒸发扩散结晶的悬滴法。 因为此法不但可节省样品而且可有效利用 储存空间。 此法是使任何挥发性的组分在 小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质 液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加, 达 到过饱和状态,最终析出晶体。晶体生长的 基本装置是Linbro多孔组织培养板及用二甲 基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料盖玻片。
悬滴法长晶体包括以下四个步骤：
• 第一步, 在作结晶实验之前，最好对蛋 白质样品进行离心， 以除去不溶解的蛋白 和杂质,以减少不必要的成核中心, 此外，对 蛋白质样品进行超滤，也是值得推荐的。 • 第二步, 采用“吹气法”除去培养晶体 用的组织培养板和盖玻片上可能带有的灰 尘。
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第三步，在组织培养板的孔中加入0.2 0.5ml经过超滤的含沉淀剂及添加剂的缓冲 液,作为池液, 孔边缘涂上真空脂。 • 第四步, 吸1ul或2ul池液放到硅化后的盖玻 片上, 加等体积蛋白溶液至此池液上 (这个 体积比将决定平衡后的蛋白质浓度)，混合 均匀， 应避免气泡出现。 • 第五步, 翻转盖玻片盖在孔上, 检查密封是 否良好。
蛋白质结晶的影响因素
• ①结晶蛋白质的纯度。获得高纯度的蛋白 质是对其进行结晶的前提。Lin 等通过采用 FPLC 快速液相色谱系统得到结晶级的蛋白 质，同时发现用此法得到的蛋白质进行结 晶，结晶的可重复性及获得晶体的衍射清 晰度都大大提高。
• ②过饱和度。溶液的过饱和度是蛋白质进 行结晶的驱动力，其本质就是过饱和溶液 的实际溶解度与饱和溶液的溶解度即该蛋 白质的溶解度之间的化学势的差值。过饱 和度的高低决定了结晶过程中成核及晶体 生长的快慢，从而决定了晶体质量的好坏
• 上述方法中步骤2和4目前己可在自动化仪 器中进行, 但是, 绝大部分拥有该仪器的实 验室最终还是乐意采用手工方法。起始的 条件实验常在感兴趣的区域(通常低于沉淀 蛋白所需的浓度)进行，然后再进行实验条 件的优化。一般的,蛋白质晶体生长所需的 硫酸胺等沉淀剂浓度在理想浓度的1%或2% 偏差范围内, 但对于不同分子量的聚乙醇胺 （PEG）则可宽松一些。 晶体在数小时至 数月后出现。 通常，微晶可用作晶种以长 出合用的晶体。
• 蒸发扩散结晶的另一种形式是坐滴法, 坐滴 中含池液和蛋白溶液各1－2ul。 此方法对 于以下情况非常适用：即使用非离子去垢 剂作为添加剂表面张力较低时；或用聚乙 二醇或乙醇作为沉淀剂 (由于凝结等问题, 悬滴体积趋于增大)时；反向扩散导致液滴 增大时；或结晶条件已确定, 需要大量晶体 时。
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• ③液/液扩散结晶又叫自由界面结晶。位于 毛细管中的样品液约10 L 和结晶液由于存 在浓度梯度，而在界面处发生自由扩散， 从而导致蛋白质溶液的过饱和及随后的结 晶。
压力
• Sazaki 等用双光束干涉仪测定了高压下的 溶菌酶蛋白四方结晶及正交结晶的溶解度 变化。实验表明，随着压力的增高其正交 结晶的溶解度降低，而四方结晶的溶解度 增大。可能是由于不同晶型的蛋白质分子 的疏水亲水程度不同，随着压力的变化， 与水的作用效果不同并反映出溶解度的变 化的不同。因此，已有越来越多的研究者 开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一 个重要的调整参数以得到目的产物。