化学发光测定仪教材

待测物
超顺磁珠
酶标记抗体 试剂1
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：
S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。
功能灵敏度： 测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度。
线性范围： （分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度
上海丰汇生物研究有限公司
化学发光介绍
发光免疫技术
▪ 发光免疫技术(luminescence immunoassay, LIA)是 将发光分析和免疫反应相结合而建立的一 种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有 发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高 度特异性,而且还具有分离简便,可以实现自 动化分析特点,使之成为医学、生物学研究 领域中一种新的重要的免疫学分析手段。
▪ ALP的发光底物 ：价格昂贵、国内无成熟 技术
(1) HRP的发光底物
常用的底物为鲁米诺或其衍生物。 ▪ 鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱
性缓冲液中进行。
（2）ALP的发光底物
▪ 常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙 烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4MUP，荧光底物）。
3.电化学发光剂
▪ 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光 的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+ （图19-1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性 电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应 。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强 氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由 基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质 子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强 的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的 [Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+. 。
3.电化学发光剂
▪ 激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出 一个波长为620nm的光子，回复到基态的三 联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复 始地进行，产生许多光子，使光信号增强 。
▪ 酶促化学发光免疫分析就是利用酶对发光 底物催化作用而直接发光，通过光强度的 测定而直接进行定量。
酶促化学发光免疫分析（双抗体夹心法）
化学发光的分类
按化学反应类型
按发光持续时间
▪ 酶促化学发光：
辣根过氧化物酶系统： 丰汇、强生
碱性磷酸酶系统： 贝克曼
▪ 非酶促化学发光：
吖啶酯系统：雅培
电化学发光：罗氏
闪光（Flash）:
发光时间在数秒内，如吖啶酯 以原位进样(In Situ Injector) 和时间积 分法测量
辉光（Glow）:
化学发光免疫技术具备以下特点 ：
▪ ①高度敏感，极限达10-17~10-19M/L，远高于RIA 、EIA、TRFIA。
▪ ②特异性强，重复性好C.V.＜10％。 ▪ ③测定范围宽，可达7个数量级。 ▪ ④试剂稳定性好，无污染有效期6－12月。 ▪ ⑤操作简单，易于自动化。
在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首 选方法。
AMPPD
▪ AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相 当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分 解半衰期，发出波长为470nm的持续性光， 在15min时其强度达到高峰，15~ 60min内 光强度保持相对稳定。
2．直接化学发光剂
▪ 这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变 溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯（ acridinium, AE）在含过氧化氢的稀碱溶液 中即能发光。
发光时间在数十分钟以上，如： HRP-Luminol系统 AP-AMPPD系统
无须原位进样、 以速率法测量。
闪光与辉光及其测量方式的差别
闪光尖Βιβλιοθήκη Baidu 发光信号
积分法测量
辉光坪区
原位进样
速率法测量
时间
发光与化学发光剂
一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，
释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (luminescence)。根据形成激发态分子的激 发能可将发光分为三种类型: 1.光照发光 2.生物发光 3.化学发光。
1. 光照发光
▪ 发光剂经短波长入射光照射后进入激发态 ，当回复至基态时发出较长波长的可见光 。
能 级
光子 电子e
基态
2. 生物发光
▪ 典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火 虫荧光素 (firefly luciferin)，在荧光素酶 (luciferase)的催化下利用ATP产能，生成 激发态的氧化萤火虫荧光素 (oxyluciferin) ，后者在回复到基态时多余的能量以光子 形式放出。
▪ 化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免 技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免 疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（ TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。
▪ 化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量 测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半 抗原）都可以用化学发光免疫技术测定。 其起步于80年代初，快速发展于90年代， 在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃 发展的阶段。
3.化学发光
▪ 化学发光是在常温下经化学反应所产生的 发射光。
▪ 化学发光是一个多步骤的过程，其机制为 某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一 个化学反应产生的能量使其产物分子或反 应中间态分子上升至电子激发态。当此产 物分子或中间态分子衰退至基态时，以发 射光子的形式释放能量(即发光)。
化学发光免疫技术中常用的化学 发光剂或发光底物
▪ 酶促反应的发光底物 ▪ 直接化学发光剂 ▪ 电化学发光剂
1．酶促反应的发光底物
酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而 发出光的一类发光底物，目前化学发光酶 免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（ HRP） 和 碱 性 磷 酸 酶 （ ALP）， 相 应 发 光 底物为：
▪ HRP的发光底物 ：价格低廉、国内技术成 熟
化学发光原理
化学发光检测主要是借助抗原和抗体在体 外特异结合后出现的各种现象，对样品中 的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检 测。 ▪ 抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答 的物质。 ▪ 抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结 合某种物质的球蛋白。
化学发光反应基本原理
双抗体夹心法（三明志法）原理