高效液相色谱课件
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高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——柱外效应
柱外峰展宽
连接管内色谱峰展宽W lc 进样造成色谱峰展宽Ws 检测器产生的色谱峰展宽Wfs
W2 ＝ Wc2＋Ws2＋Wlc2＋Wfc2
高效液相色谱
基本原理
综上所述，速率方程为：
H 2d p 2 rD u m q ( 1 k k )2d D 2 fsu ( 1 k k )2D d m p 2u
R = 1.0
两峰达97.7%分离
R 1.5
两峰完全分开
高效液相色谱
基本原理
不对称度与拖尾因子
不对称度 ＝ B/A 拖尾因子 ＝ (B + A)/2A
高效液相色谱
基本原理
小结
色谱法研究的核心：
选择最适合的色谱体系和条件、在最 短的时间达到最佳的分离效果。
高效液相色谱
基本原理
1、塔板理论
色谱理论
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 2、空心柱是否能够用于色谱分离？ 3、如何获得色谱最佳流速？
高效液相色谱
基本原理
u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：
dH dA dBdCu0 u
ddH uuB2 C0
高效液相色谱
基本原理
高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——涡流扩散（多通道效应）
起始 填充床
最后
A = 2ldp dp 粒径, l 填充因子
高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——纵向扩散
B= 2rDm 扩散系数与温度成正比，与分子量平方根 成反比，与流动相粘度成反比。
高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——传质阻力(吸附动力学)
Dm——组分在流动相中的扩散系数 由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此 在液相色谱中B可以忽略。
高效液相色谱
基本原理
（3）Cu——传质阻力项 指组分在流动相和固定相之间传质的阻力
Cq(1kk)2d D ຫໍສະໝຸດ Baidu fs (1kk)2
dp 2 Dm
固定相传质阻力 流动相传质阻力
q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度
高效液相色谱
基本原理
分 离 度0
保留因子
高效液相色谱
色谱柱 塔板数
选择性
基本原理
保留因子 分离因子α
k = (tR – t0)/t0
= tR′/t0
流动相组成；
色谱柱；
温度
α= k2/k1
色谱柱长短； 流动相流量
高效液相色谱
基本原理
分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：
R < 1.0
两峰明显重叠
完成分离。 主要分离机理：分配、吸附
高效液相色谱
基本原理
S(mV)
➢色谱图(chromatogram)
tR
➢色谱峰
➢保留时间(tR)
tR′
➢死时间(t0)
➢相对保留时间(tR′)
h
➢峰面积(A) ➢峰高(h)
t0 A
➢峰宽(W)
高效液相色谱
T(min)
色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间 分布的图象。 色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号 产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到 柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既 从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为 止所经历的时间，称为此组分的保留时间， 用tR表示，常以分（min）为时间单位。 死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称 为死时间。
H A BCu u
式中：u为流动相流动的线速度
（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散
——为填充的不规则因子
A2dp
dp——固定相颗粒粒径
高效液相色谱
基本原理
（2）B/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引 起的色谱谱带展宽
B = 2 r Dm
式中：r——弯曲因子，填充柱 r < 1 空心柱r = 1
对速率方程的讨论
• 选用细颗粒填料可获高柱效 • 流动相流速低，有利于达到高柱效 • 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 • 温度的影响 • 液膜厚度的影响
高效液相色谱
HPLC的应用
1. 与经典液相色谱法的比较：
项目
方 法 高效液相色谱法 经典液相色谱法
色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm
10 ~ 25 2 ~ 10
基本原理
2、速率理论
塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱
柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此 无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。 Van Deemter方程
1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高柱 效率的途径：
高效液相色谱
基本原理
高效液相色谱
基本原理
1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔 板数为n的色谱柱上分离的情况；
2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数 n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；
怎样提高色谱柱的理论塔板数n， 从而提高色谱柱的效率？
高效液相色谱
高效液相色谱
（High Performance Liquid Chromatography）
高效液相色谱
基本原理
高效液相色谱法原理
当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组 份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。
基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力 存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而
目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。
假设 （1）色谱柱存在多级塔板;
（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;
k p q
固定相重量 流动相重量
高效液相色谱
基本原理
理论塔板数N的计算
高效液相色谱
基本原理
相邻组分分离度的基本关系式：
分离度： R2(tR 2 tR)2tR '2 tR '1 W 1W 2 W 1W 2 或 R n2 2/11 k2' 4 2/1 1k2'
固定相粒度： 粒径/µm 筛孔/目
5 ~ 50 2500 ~ 300
色谱柱入口压力/MPa
2 ~ 20
色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 2103~ 5104
进样量/g
106 ~102
分析时间/h
0.05 ~ 1.0
高效液相色谱
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
2.与气相色谱法比较
方法 项目
高效液相色谱法
基本原理
色谱峰展宽 ——柱外效应
柱外峰展宽
连接管内色谱峰展宽W lc 进样造成色谱峰展宽Ws 检测器产生的色谱峰展宽Wfs
W2 ＝ Wc2＋Ws2＋Wlc2＋Wfc2
高效液相色谱
基本原理
综上所述，速率方程为：
H 2d p 2 rD u m q ( 1 k k )2d D 2 fsu ( 1 k k )2D d m p 2u
R = 1.0
两峰达97.7%分离
R 1.5
两峰完全分开
高效液相色谱
基本原理
不对称度与拖尾因子
不对称度 ＝ B/A 拖尾因子 ＝ (B + A)/2A
高效液相色谱
基本原理
小结
色谱法研究的核心：
选择最适合的色谱体系和条件、在最 短的时间达到最佳的分离效果。
高效液相色谱
基本原理
1、塔板理论
色谱理论
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 2、空心柱是否能够用于色谱分离？ 3、如何获得色谱最佳流速？
高效液相色谱
基本原理
u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：
dH dA dBdCu0 u
ddH uuB2 C0
高效液相色谱
基本原理
高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——涡流扩散（多通道效应）
起始 填充床
最后
A = 2ldp dp 粒径, l 填充因子
高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——纵向扩散
B= 2rDm 扩散系数与温度成正比，与分子量平方根 成反比，与流动相粘度成反比。
高效液相色谱
基本原理
色谱峰展宽 ——传质阻力(吸附动力学)
Dm——组分在流动相中的扩散系数 由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此 在液相色谱中B可以忽略。
高效液相色谱
基本原理
（3）Cu——传质阻力项 指组分在流动相和固定相之间传质的阻力
Cq(1kk)2d D ຫໍສະໝຸດ Baidu fs (1kk)2
dp 2 Dm
固定相传质阻力 流动相传质阻力
q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度
高效液相色谱
基本原理
分 离 度0
保留因子
高效液相色谱
色谱柱 塔板数
选择性
基本原理
保留因子 分离因子α
k = (tR – t0)/t0
= tR′/t0
流动相组成；
色谱柱；
温度
α= k2/k1
色谱柱长短； 流动相流量
高效液相色谱
基本原理
分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：
R < 1.0
两峰明显重叠
完成分离。 主要分离机理：分配、吸附
高效液相色谱
基本原理
S(mV)
➢色谱图(chromatogram)
tR
➢色谱峰
➢保留时间(tR)
tR′
➢死时间(t0)
➢相对保留时间(tR′)
h
➢峰面积(A) ➢峰高(h)
t0 A
➢峰宽(W)
高效液相色谱
T(min)
色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间 分布的图象。 色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号 产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到 柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既 从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为 止所经历的时间，称为此组分的保留时间， 用tR表示，常以分（min）为时间单位。 死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称 为死时间。
H A BCu u
式中：u为流动相流动的线速度
（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散
——为填充的不规则因子
A2dp
dp——固定相颗粒粒径
高效液相色谱
基本原理
（2）B/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引 起的色谱谱带展宽
B = 2 r Dm
式中：r——弯曲因子，填充柱 r < 1 空心柱r = 1
对速率方程的讨论
• 选用细颗粒填料可获高柱效 • 流动相流速低，有利于达到高柱效 • 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 • 温度的影响 • 液膜厚度的影响
高效液相色谱
HPLC的应用
1. 与经典液相色谱法的比较：
项目
方 法 高效液相色谱法 经典液相色谱法
色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm
10 ~ 25 2 ~ 10
基本原理
2、速率理论
塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱
柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此 无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。 Van Deemter方程
1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高柱 效率的途径：
高效液相色谱
基本原理
高效液相色谱
基本原理
1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔 板数为n的色谱柱上分离的情况；
2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数 n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；
怎样提高色谱柱的理论塔板数n， 从而提高色谱柱的效率？
高效液相色谱
高效液相色谱
（High Performance Liquid Chromatography）
高效液相色谱
基本原理
高效液相色谱法原理
当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组 份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。
基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力 存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而
目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。
假设 （1）色谱柱存在多级塔板;
（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;
k p q
固定相重量 流动相重量
高效液相色谱
基本原理
理论塔板数N的计算
高效液相色谱
基本原理
相邻组分分离度的基本关系式：
分离度： R2(tR 2 tR)2tR '2 tR '1 W 1W 2 W 1W 2 或 R n2 2/11 k2' 4 2/1 1k2'
固定相粒度： 粒径/µm 筛孔/目
5 ~ 50 2500 ~ 300
色谱柱入口压力/MPa
2 ~ 20
色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 2103~ 5104
进样量/g
106 ~102
分析时间/h
0.05 ~ 1.0
高效液相色谱
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
2.与气相色谱法比较
方法 项目
高效液相色谱法