SN出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
3、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌
↓36±1℃,48±2h
↓44.5±0.5℃,24±2h
————————
———————
↓
↓
↓
↓
浑浊，产气
不产气 浑浊，产气 不产气：粪大肠菌群阴性
查MPN表
大肠菌群阴性 查MPN表
报告大肠菌群
报告粪大肠菌群
的MPN值
的MPN值
大肠菌群计数检验的操作
MPN法
LST不产气（-） 小导管里无气泡
LST产气（+）
36℃±1 ℃ 培养24h
加入 Kovacs氏试剂
接触面红色，阳性
甲基红反应(MR)
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖 过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的 途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大 量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使 甲基红指示剂变红。
VRBA平板计数法
选择15~150平 板计数典型和
可疑菌落
36℃±1 ℃ 18h ~24h
典型菌落为紫红色 周围有红色胆盐沉
淀环，0.5mm
挑选10个菌落 接种到BGLB
结果报告
经最后证实大肠菌群阳性的BGLB试管比 例乘以VRBA菌落数再乘以稀释倍数，即为每 克（毫升）样品中大肠菌群数。 如：稀释倍数10-3 ,吸取样品稀释液1ml
大肠菌群和粪大肠菌群的检测流程图 MPN法
检样25g
↓
稀释（三个连续的稀释度，如10-1，10-2，10-3）
↓
接种（每个稀释度接种3管LST，每管1ml）
↓ 36±1℃,48±2h
——————————————
↓
↓
浑浊，产气
不产气
↓
报告大肠菌群阴性
出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法
出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法1.仪器和设备1. 1恒温培养箱：36 ± 1 C1. 2恒温水浴箱：44.5 ± 1C1. 3高压灭菌锅1. 4均质器1. 5 试管:18 x 150mm 18 x 180mm1. 6 锥形瓶:500ml 250ml1. 7平皿：直径为90mm1. 8灭菌均质杯1. 9灭菌吸管1. 10酒精棉1.11天平：感量0.1g1.12 冰箱：0-4 C 和-15 〜-20 C1.13显微镜2.培养基的制备2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤称35.6g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18 x 180mm试管中，每管10ml，于121 C高压灭菌15min。
2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB称40g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18x 180mm 试管中，每管10ml, 121 C高压灭菌15min。
2.3EC肉汤称37g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18x 180mm 试管中，每管吸8ml, 121 C高压灭菌15min。
2.4伊红美蓝琼脂（EMB称37.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶，121 C高压灭菌15min。
摇匀冷却至45 C倾注平皿。
2.5营养琼脂称33g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，121 C高压灭菌15min。
制成斜面备用。
2.6生理盐水称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18x 150mm试管内，121 C高压灭菌15min。
2.7成品生化管2.7.1 色氨酸肉汤2.7.2 MR-VP 2.7.3 Koser 氏枸橼酸盐琼脂2.7.4 革兰氏染色试剂盒2.7.5 Kovacs 氏靛基质试剂2.7.6甲基红指示剂2.7.7 V-P 试剂甲液和乙液3.操作步骤3.1样品的稀释和培养3.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。
原料验收监控计划
原料验收监控计划原料验收监控计划原料验收的监控计划一、相关检验方法标准依据1、SN033094《出口食品中微生物学检验通则》2、SN016892《出口食品平板菌落计数》3、SN016992《出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》4、SN017092《出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法》5、SN017292《出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法》、ISO068881999（E）《金黄色葡萄球菌检测和计数方法》6、NMKL-No156-1997《食品中致病性弧菌的检测和计数》7、SN078493《出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法》8、氯霉素ELISA试剂盒检测法9、硝基呋喃及代谢物LC/MS/MS检测法二、原料监控体系的机构设置和职责分工A、收购负责人：1、负责贯彻执行国家有关水产业的法律法规和方针政策，制定收购点的有关管理制定，并对实施情况进行监督检查。
2、在龙虾收购前负责对原料产区的水质和原料的抽样检测工作的实施。
确保在收购前将所有的收购证件办理到位，给公司提供一个安全原料收购区域。
3、负责对每天各个供应商的捕捞的小龙虾进行收购质量的把关。
同时，对所有供货的供货证明要严格检查，必要时对捕捞者进行有关法律法规方面的知识培训，使他们对有关原料安全项目引起注重，从而保证原料的安全性。
4、负责对收购点的收购原料实施监控，保证收购点的原料质量的安全性。
5、负责监督对原料虾的运输等工作，使原料能够安全到达公司。
B、收购点挑选人员工作职责：1、对所有收购的原料虾，都要按公司的要求进行认真挑选出残虾、杂质、不达规格等。
2、对所有的挑选后的原料虾要按先后的顺序进行摆放好，不得出现不合格的龙虾。
C、收购点的运输人员工作职责：1、对所有的小龙虾按收购的先后顺序进行运往公司等加工。
2、对所有的工器具必须每天要规范清洗消毒到位后再进行使用。
3、将收购的所有收购凭证及时的收回以便公司进行核查。
D、公司验收人员（品控部）的工作职责：1、首先对每批进公司的原料虾验收记录表的核查；2、检查每车的装虾的工器具是否达到清洁卫生的标准。
食品卫生微生物学检验 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌计数
大肠菌群计数：第一法 6 操作步骤
6.2 初发酵实验 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液体 样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释度接种三管月桂基硫酸 盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL， 则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气 泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如 未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管 数。未产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。
食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of Escherichia coli
大肠菌群计数
大肠菌群
定义：一群在36℃条件下培养24~48小时能发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属 和柠檬酸杆菌属等的细菌 检验比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加 工卫生状况的通用指标
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of Coliforms
食品卫生微生物学检验 粪大肠菌群计数
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of faecal coliforms
℃± 1 ℃ 36 36℃
验
24h~ 48h
报告结果
大肠菌群计数
大肠菌群计数
大肠菌群计数
第一法
MPN法
第二法 平板计数法 第三法 Petrifilm测试片法
MMFSCNJ出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
MM_FS_CNJ_03出口食品大肠菌群粪大肠菌群大肠杆菌测定MM_FS_CNJ_0334出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法1. 适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2. 主要试剂和仪器. 主要试剂（包括培养基）月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST肉汤；煌绿乳糖胆盐（BGLB肉汤；EC肉汤；伊红美蓝琼脂（EMB）；营养琼脂斜面；色氨酸肉汤；MR-VP培养基；Korser 氏枸椽酸盐肉汤；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液；生理盐水；革兰氏染色液；Kovacs 氏靛基质试剂；甲基红指示剂；Voges— pros kauer （V-P）试剂。
. 仪器吸管：1mL具刻度；5mL和10mL具1mL刻度；水浴箱：±C；培养箱：36 ±1 °C, 土°C；冰箱：0〜5C和—15〜—20C；均质器；乳钵和研棒；平皿：直径90mm；天平：感量；显微镜；稀释瓶：100mL 200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶；玻璃珠：直径约5mm；菌落计数器。
3. 过程简述. 样品制备以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4C冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2〜5C 18h内解冻，或在45C以下15min内解冻。
不同食品样品匀液的制备. 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1 : 10的样品匀液。
. 固体和半固体食品以无菌操作取样25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r /min 均质1〜2min,制成1 : 10样品匀液（也可用灭菌乳体研磨的方法代替）。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，女口10〈10 3> 10 4 ........................................... 。
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测是一项非常重要的检测方法，可以帮助医生了解肠道菌群的健
康状况，对于一些肠道疾病的诊断和治疗具有重要的指导意义。
目前，常见的粪大肠菌群检测方法主要包括传统培养法、分子生物学方法和代谢产物分析法。
传统培养法是最早被使用的检测方法之一，其原理是将粪便样本在特定的培养
基上进行培养，然后观察和计数不同菌种的数量。
这种方法简单易行，但是存在着检测时间长、无法培养一些难以培养的菌种等缺点。
分子生物学方法是近年来得到广泛应用的一种检测方法，其原理是通过PCR
扩增、测序等技术，对粪便样本中的微生物DNA进行检测和分析。
这种方法可以
快速、准确地获取肠道微生物的信息，但是需要专业的设备和技术人员进行操作，成本较高。
代谢产物分析法是一种新兴的检测方法，其原理是通过检测粪便中微生物代谢
产物的种类和含量，来推断肠道微生物的组成和功能状态。
这种方法无需培养微生物，可以直接反映微生物的活动情况，但是目前仍处于研究阶段，需要更多的临床验证。
除了以上几种方法外，近年来还出现了一些新的粪大肠菌群检测技术，如16S rRNA测序技术、宏基因组测序技术等，这些新技术在提高检测灵敏度、准确性和
全面性方面具有一定优势，但是也存在着技术门槛高、设备昂贵等问题。
总的来说，粪大肠菌群检测方法在不断地发展和完善，不同的方法各有优缺点，应根据具体的临床需求和实际情况选择合适的检测方法。
未来随着技术的不断进步，相信粪大肠菌群检测方法会更加快速、准确、全面，为肠道健康的评估和疾病的诊断治疗提供更好的帮助。
出口食品车间的工艺卫生及成品微生物的标准及检验方法
微生物检验标准编号：ⅢA-03-8008-0第1页共7 页第次修改一、适用范围：本标准规定了出口食品车间的工艺卫生及成品微生物的标准及检验方法。
本标准适用于实罐一、三车间、面食车间工艺卫生，公司所有产品的成品微生物检验及生产用水的水质检验。
二、术语：1、工艺卫生：指食品加工工艺过程中卫生指标控制情况，一般包括操作者的手、操作案台，直接接触食品的工器具、空气落菌、半成品、车间用水等的微生物卫生情况。
2、内包装材料：直接接触食品的包装材料，包括塑料袋，塑料片等。
3、菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后﹙如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等﹚，所得1ml(g)检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
4、大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
三、卫生标准：物品项目单位细菌总数大肠菌群备注操作台、工器具个/100cm2 ≤1.0×104＜50 生加工区不得检出熟加工区操作者手个/只掌面≤1.0×104＜50 生加工区不得检出熟加工区空气落菌个/平板≤50/ 生加工区≤30/ 熟加工区内包装材料个/100cm2 ≤2.0×102不得检出微生物检验标准编号：ⅢA-03-8008-0第2 页共7 页第次修改半成品个/g（ml）≤5.0×105 ≤1.0×103生加工区≤1.0×105不得检出熟加工区成品按各种产品成品标准四、检验方法：（一）工艺卫生：生产正常进行时，每周检验一次。
1、车间工艺卫生检验大肠菌群的检验方法：1.1培养基：大肠菌群菌落计数培养基。
1.1.1成份：蛋白胨10克氯化钠5克磷酸氢二钾（K2HPO4）2克或K2HPO43H2O 2.62克乳糖10克去氧胆酸钠1克琼脂15克柠檬酸铁铵2克中性红0.033克或0.0412克（国产）蒸馏水1000ml1.1.2制法：蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾加入蒸馏水加热溶解，并用10%碳酸钠溶液调PH7.3-7.5，加琼脂溶化再加柠檬酸铁铵、去氧胆酸钠溶解后，补充消耗水份，用250ml三角瓶分装。
食品微生物大肠菌群检测方法
食品微生物大肠菌群检测方法食品微生物大肠菌群检测是食品安全监管中的重要环节，大肠菌群是一类常见的致病微生物，其存在可能会对食品质量和消费者健康造成严重威胁。
因此，建立一套有效的检测方法对于保障食品安全至关重要。
本文将介绍几种常用的食品微生物大肠菌群检测方法，希望能为相关从业人员提供一些参考。
首先，传统的培养法是一种常见的大肠菌群检测方法。
该方法通过将食品样品在适宜的培养基上培养，利用大肠菌群特有的形态、生理生化特性进行鉴定和计数。
尽管该方法操作简单，成本较低，但是需要较长的培养周期，且存在假阳性结果的可能性。
因此，在实际应用中需要结合其他方法进行验证。
其次，分子生物学方法在食品微生物大肠菌群检测中也得到了广泛应用。
PCR技术是其中的代表，通过特异性引物扩增靶标基因，再通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR技术进行检测和定量。
这种方法具有高度的特异性和灵敏度，能够快速准确地检测出样品中的大肠菌群，但是需要较为复杂的实验操作和昂贵的设备。
另外，近年来，免疫学方法也逐渐在食品微生物大肠菌群检测中得到了应用。
免疫学方法利用抗原与抗体的特异性结合进行检测，具有高度的特异性和灵敏度，且操作简便，适用于大批量样品的检测。
然而，该方法的缺点是需要制备特异性抗体，成本较高，且可能受到样品复杂性的影响。
最后，近年来，基于生物传感技术的大肠菌群检测方法也逐渐受到关注。
生物传感技术利用生物识别元件与传感器相结合，能够实现对微生物的高灵敏、高特异检测。
这种方法具有快速、准确、实时监测的特点，但是需要特定的生物传感器和信号检测设备，成本较高。
综上所述，食品微生物大肠菌群检测方法多种多样，各有优缺点，具体选择应根据实际需求和条件进行综合考虑。
在今后的食品安全监管中，希望能够不断完善和发展新的检测技术，以更好地保障食品安全，保障消费者的健康。
食品微生物大肠菌群检测方法
食品微生物大肠菌群检测方法食品微生物大肠菌群检测是食品安全监管的重要环节，大肠菌群作为一类潜在致病菌，其检测对于评估食品的卫生质量至关重要。
本文将介绍几种常见的食品微生物大肠菌群检测方法，希望能够为食品安全监管工作提供参考。
首先，传统的培养法是一种常见的大肠菌群检测方法。
该方法通过将食品样品接种在含有特定营养成分的培养基上，利用大肠菌群的特定生长条件，观察并计数培养基上产生的典型菌落。
然而，传统培养法存在着操作复杂、耗时长、无法检测非可培养菌等问题，因此逐渐被更为快速、准确的方法所替代。
其次，分子生物学方法在大肠菌群检测中得到了广泛应用。
其中，聚合酶链式反应（PCR）技术是一种常用的分子生物学方法，通过特异性引物扩增目标DNA片段，再通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR技术进行定量分析。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和快速的优点，能够在较短时间内完成大肠菌群的检测，但其需要较为复杂的实验操作和昂贵的设备。
此外，近年来，基于生物传感技术的大肠菌群检测方法也得到了迅速发展。
生物传感技术利用生物元件对靶分子的高度选择性识别，将生物识别转换为可测量的信号输出。
例如，免疫传感技术利用抗体对大肠菌群的特异性识别，通过免疫反应产生信号，实现对大肠菌群的快速检测。
生物传感技术具有高灵敏度、快速、便携等优点，逐渐成为食品微生物检测领域的研究热点。
除了上述方法外，近年来，基于纳米材料的大肠菌群检测方法也备受关注。
纳米材料具有较大的比表面积和特殊的光电性能，能够提高生物传感器的灵敏度和稳定性。
例如，利用金纳米颗粒标记抗体，通过光谱法或电化学法实现对大肠菌群的高灵敏检测。
纳米材料的应用为大肠菌群检测提供了新的思路和方法。
综上所述，食品微生物大肠菌群检测方法多种多样，各具特点。
在实际应用中，可以根据检测的目的、样品的性质和实验条件等因素选择合适的检测方法。
随着科学技术的不断进步，相信食品微生物大肠菌群检测方法将会更加快速、准确、简便，为食品安全监管工作提供更为有力的支持。
大肠菌群及大肠杆菌检测方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for examination of coliform ，fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 —92代替ZB X09 002 —861 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料2.1吸管：1mL，具O.ImL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5 ±.5C。
2.3 培养箱：36±1C, 44.5 ±.5C。
2.4冰箱：0〜5 C和-15〜-20Co2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm o2.8 天平：感量0.1g o2.9显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm o2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂3.1月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤。
3.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂（EMB）o3.5营养琼脂斜面。
3.6色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP 培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）o3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15 Voges—pros kauer（V —P）试剂。
4 样品制备4.1以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4C冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2—5C 18h内解冻，或在45C以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL 放入装有225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm 幅度、于7s 内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1 : 10的样品匀液。
进出口SN标准微生物检测方法之大肠杆菌和大肠菌群计数方法
大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：·传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法·LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）·瓶装水检测方法·贝类和贝类肉制品检测方法·柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法·大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法·参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。
虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。
由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。
再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。
与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。
肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂 。
于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。
1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。
于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。
【实用文档】SN0169-92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
SN0169-92代替ZBX09002一88 Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport 1、主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2、设备和材料2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3、培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7MR-VP培养基。
3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。
4、样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
食品中大肠菌群的检验
食品中大肠菌群的检验简介大肠菌群是指含有大肠菌属（Escherichia coli）和奇异变形杆菌属（Coliform bacteria）的细菌群体。
它们存在于人和动物的肠道中，也可以存在于环境中，如土壤、水体和食品中。
食品中的大肠菌群是导致食品中毒的主要病原体之一。
因此，对食品中大肠菌群的检验非常重要，以确保食品的卫生和安全。
本文将介绍食品中大肠菌群的检验方法和操作流程。
方法和步骤1. 样品采集样品采集是食品中大肠菌群检验的第一步。
根据需要检验的食品种类，选择合适的采样方法。
常见的食品样品包括水果、蔬菜、肉类和乳制品等。
采集样品时，应使用干净无菌的容器，并避免污染。
确保样品的代表性，避免极端状况下的取样，如选择已烂的水果或有明显变质的食品。
2. 样品处理样品处理是为了提取样品中的菌群以进行后续的检测。
处理过程应在无菌条件下进行，以避免外部的污染。
常见的样品处理方法包括：•加入盐水：将样品加入含有氯化钠的缓冲液中，以便菌群的释放。
•搅拌和均质：使用搅拌器或者均质器将样品搅拌均匀，以确保菌群的均匀分布。
•过滤：通过滤膜将样品过滤，以分离固体物质和悬浮物。
3. 培养基选择选择适当的培养基是进行大肠菌群检验的关键。
常用的培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（Plate Count Agar，PCA）、大肠杆菌选择琼脂（MacConkey Agar）、经典蓝琼脂（Eosin Methylene Blue Agar）等。
不同的培养基适用于不同目的的检验。
PCA适用于总菌群计数，MacConkey Agar适用于大肠菌群的选择性检测，Eosin Methylene Blue Agar适用于大肠杆菌的计数和鉴别。
4. 培养和孵育将样品处理后的培养基平板进行孵育。
孵育的时间和温度根据菌群的生长特性而定。
一般情况下，孵育时间为24小时，温度为37摄氏度。
培养过程中，需要注意避免交叉污染。
每个样品应使用独立的培养基平板进行孵育，且标记清楚以区分不同样品。
大肠菌群和粪大肠菌的检验
实验四大肠菌群和粪大肠菌的检验一、实验目的要求1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。
二、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。
三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶2个制生理盐水3、250ml三角瓶1个制EMB琼脂4、18×180mm试管8支稀释及制双料乳糖胆盐发酵管5、18×150mm试管20～25支单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管6、13×130mm试管20支制蛋白胨水、EC肉汤7、1ml移液管 5 支8、10ml移液管 3 支9、直径为90mm平皿12套制EMB平板10、250ml量筒1支（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把开瓶器不锈钢药匙1把滴管胶头4只称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1、0.85%NaCl生理盐水300ml 500ml三角瓶2、乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支5支60ml 18×180mm试管(装有导管)单料：10ml/ 8支90ml 18×150mm试管(装有导管)3、EMB琼脂：1瓶120ml 250ml三角瓶4、乳糖发酵管：3ml/支5支20ml 13×130mm试管(装有导管)5、EC肉汤：3ml/支6支20ml 13×130mm试管(装有导管)6、蛋白胨水：2ml/支10支20ml 13×130mm试管四、实验内容（第一天）样品处理及初发酵接种：所需培养基与器材：? 培养基：1. 0.85%NaCl生理盐水：300ml 1瓶2. 乳糖胆盐发酵管双料：10ml/支3～5支18×180mm试管(有导管)单料：10ml/支6～8支18×150mm试管(有导管)? 灭菌器材：500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠）1～2个18×180mm试管3支250ml量筒1支1ml移液管 5 支10ml移液管3支当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只；当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。
大肠杆菌的检测
食品中大肠杆菌的检测大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
卫生学意义大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
检测程序大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别伊红和美蓝可抑制G+生长；不发酵乳糖的细菌菌落无色透明；能发酵乳糖，产酸力弱，菌落为棕色；发酵乳酸，产酸能力强，菌落紫色，有绿色金属闪光EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽、测定方法：1 检样稀释：1.1 以无菌操作将检样25ml(或25g放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中，经充分振摇成1：10均匀稀释液。
1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管中，振摇成1：100稀释液。
1.3 重复1.2的操作，使成1：1000稀释液。
2乳糖胆盐发酵试验：根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择二个稀释度，每一稀释度接种3管，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管。
1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
大肠杆菌检测方法
大肠菌群及检验一、大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名, 而是卫生细菌领域用语, 它不代表某一个或某一属细菌, 而指是含有一些特征一组与粪便污染相关细菌, 这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致, 其定义为: 需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气革兰氏阴性无芽胞杆菌。
通常认为该菌群细菌可包含大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广, 在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明, 大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类常常活动场所以及有粪便污染地方, 人、畜粪便对外界环境污染是大肠菌群在自然界存在关键原因。
粪便中多以经典大肠杆菌为主, 而外界环境中则以大肠菌群其她型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来, 关键是以该菌群检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数高低, 表明了粪便污染程度, 也反应了对人体健康危害性大小。
粪便是人类肠道排泄物, 其中有健康人粪便, 也有肠道患者或带菌者粪便, 所以粪便内除通常正常细菌外, 同时也会有部分肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等）, 所以食品中有粪便污染, 则能够推测该食品中存在着肠道致病菌污染可能性, 潜伏着食物中毒和流行病威胁, 必需看作对人体健康含有潜在危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量关键指标之一, 现在已被中国外广泛应用于食品卫生工作中。
二、大肠菌群检验方法:因为大肠菌群指是含有一些特征一组与粪便污染相关细菌, 即: 需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气革兰氏阴性无芽胞杆菌。
所以大肠菌群检测通常都是根据它定义进行。
现在中国采取进出口食品大肠菌群检测方法关键有国家标准和原国家商检局制订行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不一样。
（一）国家标准: 国家标准采取三步法, 即: 乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验: 样品稀释后, 选择三个稀释度, 每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。
36±1℃培养48±2h, 观察是否产气。
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SN0169-92代替ZBX09002一88 Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport 1、主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2、设备和材料2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3、培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7MR-VP培养基。
3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。
4、样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5、大肠菌群的测定5.1 大肠菌群MPN值的测定5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表[见附录B(补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6、粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。
水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。
应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。
产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7、大肠杆菌测定7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。
7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm 试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4LST肉汤：于36±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8、大肠菌群固体培养基测定法8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。
另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±1℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。
对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10-4/g(mL)＝6.0×105/g(mL)附录A培养基和试剂(补充件)A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤胰蛋白(胨)或胰酪胨(Trypticase) 20g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾 2.75g磷酸二氢钾 2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL0.1％煌绿水溶液13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5)，用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。
再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.2±0.1。
A3EC肉汤胰蛋白(胨)或胰酪(胨)20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾 4.0g磷酸二氢钾 1.5g氯化钠 5.0g蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。
121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾 2.0g琼脂15.0g伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL美蓝0.065g或0.5％水溶液13mL蒸馏水1000.0mL在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。
分装于三角烧瓶中。
每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。
最终pH7.1±0.2。
使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mL将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。
分装合适的试管。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.3±0.1。
灭菌后摆成斜面备用。
A6 色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨10.0g蒸馏水1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。
分装试管，每管5mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.9±0.2。
A7MR-VP培养基(胨)胨7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.2。
A8Koser氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。