超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD、CAT、POD等的活性测试方法

SOD 、CAT 、POD 测定方法一、超氧化物歧化酶（一、超氧化物歧化酶（SOD SOD SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法））活性测定（氮蓝四唑光化还原法））活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制、试剂的配制（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(PBS (PBS (PBS，，pH7.8)pH7.8)：：A 母液：母液：0.2mol/L 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液: : 取Na2HPO4Na2HPO4••12H2O （分子量358.14358.14））71.7g 71.7g；；B 母液：母液：0.2mol/L 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4NaH2PO4••2H2O 2H2O（分子量（分子量156.01156.01））31.2g 31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml 1000ml。

0.05mol/L PBS （pH7.8pH7.8）的配制：分别取）的配制：分别取A 母液母液(Na2HPO4) 228.75ml (Na2HPO4) 228.75ml ，B 母液(NaH2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1000ml 1000ml。

（2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met 用磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8））定容至1000ml 1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml 100ml。

（4）60μM 核黄素溶液：核黄素溶液：取取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml 100ml，，避光保存。

存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑氮蓝四唑(NBT)(NBT)(NBT)溶液：取溶液：取0.1840g NBT 用PBS 定容至100ml 100ml，避光，避光保存。

保存。

酶液制备：取0.2g 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8））在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、℃、12000g 12000g 下离心20min 20min，上清液即为酶液。

实验14 氮蓝四唑(NBT)法测定超氧物歧化酶(SOD)活力

实验14 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.05, 2支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应10min-~20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

实验三超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定

3.3 结果计算总酶活力=酶液总体积X稀释倍数/抑制 50%的酶液量X样品重
五、本实验教学内容的重点和难点
重点：粗提液的获得玉米SOD的提取难点：提取条件的控制
六、本实验教学内的深化和拓展
通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物 SOD与动物SOD的区别，了解植物SOD的优势。
七、思考题，完成实验报告
1 什么是分段盐析，为什么要分段盐析？ 2 SOD有哪些用途？
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心 15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于5560℃热处理15min，得到SOD酶液。
3.2 SOD活性测定试剂（mL）空白对照管样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 EDTA溶液 0.5 0.5 蒸馏水 0.5 — 样品液 — 0.5 混合均匀，在30℃水浴中预热5min，测定 OD480
四、操作步骤
4.1 SOD粗提液的制备
1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣或玉米种子，置于研钵中研磨。 2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3 倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。 3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心 15min，得到的上清液为粗酶液。
三、材料与试剂
1. 材料
l/L磷酸缓冲液（pH7.8）,500mL 2、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 3、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 4、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 5、0.1mol/LEDTA溶液

4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片。

（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。

（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO4，按体积9:1混合，如pH高或低于7.8，则用KH2PO4或Na2HPO4调节。

每1000mL缓冲液含8gNaCl，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。

（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用现配。

超氧化物歧化酶的活性测定

超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。

其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。

在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

超氧化物歧化酶活性的测定

植物生理学模块实验指导李玲主编科学出版社超氧化物歧化酶的测定方法【实验目的】学习测定超氧化物歧化酶活性的方法。

【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动植物与微生物体内。

SOD是含金属辅基的酶。

高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。

SOD能够清除超氧阴离子自由基（O2—·），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O2—·）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。

超氧化物歧化酶催化以下反应：2 O2—·+ 2H+ ═H2O2+O2超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD活性。

本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。

被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2—·。

当加入NBT 后，在光照条件下O2—·又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。

当加入SOD时，SOD可通过清除O2—·，而抑制NBT的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。

于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。

抑制NBT光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。

常常将抑制50%的NBT光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U）。

【器材与试剂】1.实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、微量移液枪、离心管、光照箱（光照度为4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）2.实验试剂0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。

酶提取缓冲液：称取77mg DTT、5g PVP，加入0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8），定容至100ml，摇匀，即得提取缓冲液（含5mmol/L DTT和5% PVP），低温（4℃）贮藏备用。

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力

氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力一、目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算方法。

二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除O 2-，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活力单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。

222222SOD O H H O O -+−−−→+222222CAT H O H O O −−−→+三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx ）；5.试管（三）试剂：1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P048.5 ml ）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ；3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存；4. 100μmol/L EDTA －Na 2溶液：称取0.03721gEDTA －Na 2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。

四、实验步骤1. 酶液提取：取叶片0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为10ml ，取5ml 于4度下4000rpm 离心15min ，上清液即为SOD 粗提液。

超氧化物歧化酶活性的测定

超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。

因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。

超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。

步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。

2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。

3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。

4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。

5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。

6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。

7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。

超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。

1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。

SOD测定方法

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。

在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定方法SOD（超氧化物歧化酶）是一种重要的抗氧化酶，通过催化O2.-的自动氧化为O2和H2O2来清除有害氧自由基。

SOD的活性能够反映生物体内清除氧自由基的能力，因此SOD活性的测定对于研究氧自由基相关疾病以及抗氧化剂的评价具有重要意义。

以下是目前常用的几种SOD活性的测定方法：1. Nitroblue tetrazolium (NBT)法：这是最早用于测定SOD活性的方法之一、该方法基于超氧自由基能够氧化NBT成为紫色的甲胺蓝（blue formazan）。

SOD能够阻止NBT的氧化过程，从而减少blue formazan的产生。

测定时，试样中的NBT和蛋白质混合后加入酶底物，通过测定产生的blue formazan的吸光度来评估SOD的活性。

2. epinephrine autoxidation法：该方法基于SOD能够催化抑制肾上腺素自动氧化反应，从而测定其活性。

肾上腺素在氧气存在下会自动氧化生成可见光吸收的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程，减少可见光吸收的产生。

通过测定反应体系中可见光吸收的变化来评估SOD的活性。

3. Pyrogallol autoxidation法：该方法与上述方法类似，基于SOD能够催化抑制邻二氧苯酚（pyrogallol）自动氧化反应，从而测定其活性。

邻二氧苯酚在氧气存在下会自动氧化生成氧的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程。

通过测定反应体系中氧的产生速率或者邻二氧苯酚消耗速率来评估SOD的活性。

4. Xanthine oxidase法：该方法基于SOD能够催化脲酶氧化邻位双黄嘌呤（xanthine）生成尿酸，而脲酶则通过XOD（xanthine oxidase）作用于氧气生成邻位双黄嘌呤的过程来实现。

由于SOD能够清除产生的超氧自由基，从而减少尿酸的生成。

通过测定尿酸产生的速率来评估SOD的活性。

这些方法各自具有一定的优缺点，研究者们需要根据实际需要选择合适的方法来测定SOD活性。

植物组织中超氧化物歧化酶活性测定

植物组织中超氧化物歧化酶活性测定植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是一项重要的生物化学实验，它有助于了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。

以下是测定植物组织中超氧化物歧化酶活性的实验步骤和注意事项。

一、实验材料1.实验植物：选择新鲜、健康的植物组织，如叶片、根或茎。

2.实验试剂：包括磷酸缓冲液（pH 7.8）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、酶提取液等。

3.实验设备：包括分光光度计、离心机、研钵、试管、滴定管等。

二、实验步骤1.酶提取：将植物组织研碎，加入适量的酶提取液，充分研磨并混合均匀，然后置于离心机中以3000-4000 r/min的速度离心10-15分钟，得到清亮的上清液。

2.酶活性测定：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）、0.1毫升的核黄素和0.002毫升的酶提取液，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。

3.空白对照：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）和0.1毫升的核黄素，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。

4.数据记录：记录酶活性测定和空白对照的吸光度值，并计算超氧化物歧化酶活性。

三、注意事项1.实验过程中要保证所用试剂的纯度和新鲜度，避免影响实验结果。

2.离心机使用前应预热，保证离心的效果和效率。

3.在酶活性测定中，加入酶提取液时应十分小心，避免产生气泡，影响吸光度的测定。

4.在整个实验过程中要保证温度、光照等环境因素的一致性，以减小误差。

5.在数据处理时，应按照公式计算超氧化物歧化酶活性，并进行统计分析和比较。

四、结果分析通过对实验数据的分析，可以得出不同植物组织中超氧化物歧化酶活性的大小及其变化规律。

这些数据可以帮助我们了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。

例如，当植物受到逆境条件的影响时，超氧化物歧化酶的活性可能会发生变化，通过比较不同植物组织的超氧化物歧化酶活性，可以筛选出抗逆性较强的植物品种，为农业生产提供参考。

SOD测定方法

SOD测定方法SOD（超氧化物歧化酶）是一种抗氧化酶，主要作用是通过催化超氧自由基（O2-）的歧化反应，将其转化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2），从而保护细胞免受氧化损伤。

由于SOD在生理病理过程中起着重要作用，因此测定SOD活性对于研究氧化应激反应及疾病机制具有重要意义。

下面将介绍几种常见的SOD测定方法。

1.氧化还原法氧化还原法是目前应用较广泛的SOD测定方法之一、该方法基于SOD活性的表现为它能阻止自由基与还原型化合物（如亚硝酸钠）之间的反应。

通过测定反应体系中亚硝酸钠的降解速率可计算出SOD的活性。

这种方法简单易行，但可能受到其他抗氧化酶和化合物的干扰。

2.锰硞合成法锰硞合成法是一种经典的SOD测定方法，它利用SOD对超氧自由基的清除作用而催化锰硞的合成。

反应结束后，通过测定合成的锰硞的吸光度变化来计算SOD的活性。

这种方法比较准确，但操作较繁琐，不适合大规模高通量实验。

3.硝苯蓝法硝苯蓝法基于硝苯蓝的还原能力受SOD活性影响的原理。

在碱性条件下，硝苯蓝与NADH反应生成可溶性复合物，其吸光度与SOD的活性成负相关关系。

通过测定反应体系的吸光度变化可以计算出SOD的活性。

该方法操作简便，但对于抗氧化剂和金属离子敏感，可能会引起误差。

4.含乙酰亚胺百日咳法该方法利用含乙酰亚胺的百日咳试剂来测定SOD活性。

该试剂在碱性条件下能与过氧化氢反应，生成已知稳定的有色化合物。

SOD活性越高，生成的有色化合物越少，通过测定反应体系的吸光度变化可以计算出SOD 的活性。

该方法操作简单，结果可重复性好，但对于有机溶剂和金属离子敏感。

5.X-射线发射荧光法X-射线发射荧光法是一种新型的SOD测定方法。

该方法通过测定SOD 催化超氧自由基与荧光染料之间的作用，计算出SOD的活性。

这种方法灵敏度高，精度好，同时能够快速高效地测定多个样品，适用于大规模高通量实验。

综上所述，SOD的测定方法有很多种，选择适合自己研究的方法需要综合考虑测定条件、样本的特点以及所需的准确度和灵敏度等因素。

SOD实验资料 (2)

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定淡蓝四唑（NBT）法一、实验目的1、了解氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理。

2、掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本操作方法。

二、实验原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

三、材料、仪器设备及试剂（一）材料香梨树的树皮（二）仪器设备Anke GL_20G_II高速冷冻离心机，UV-2102 C 型紫外可见分光光度计，MODEL：ST-150P光照培养箱，微量进样器，恒温水浴锅，研磨工具，离心管，容量瓶，烧杯，试管或指形管数支。

（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

91.5ml 0.05Mol/L Na2HPO4+8.5ml 0.05Mol/L NaH2PO4。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（4）100µmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。

（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。

生理指标测定方案

一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 2O2-+ 2H →H2O2+O2。

本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

（一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照的一半（50%）时所需的酶量。

）二、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻或小麦叶片。

（二）仪器设备高速冷冻离心机，紫外分光光度计，日光灯（反应试管处照度为4000lx），试管数支。

（三）试剂（1）0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液 (PBS)。

配制方法：①母液A（0.2mol/L Na2HPO4）:称取71.64g Na2HPO4·12H2O,用蒸馏水定容至1000ml 。

(配置溶液时需要用磁力搅拌器搅拌才能溶解。

)②母液B(0.2mol/L NaH2PO4)：称取31.21g NaH2PO4·2H2O,用蒸馏水定容至1000ml 。

③配0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液：取91.5mlA母液+8.5mlB母液+蒸馏水定容到400ml （2）提取介质0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液，内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）: 称取1g PVP用0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液 (PBS)定容到100ml（3）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性国标测定方法

国家标准以修改Marklund方法和化学发光法测定食品中SOD活性。

前者SOD最低的检测浓度为1.17U/mL，相当于1.1*10-8mol/L，方法灵敏，仪器廉价，易于推广；后者SOD活性测定最低检出浓度为0.033U/mL,灵敏度比前者提高约两个数量级。

具有更加灵敏、快速和干扰少等优点，但是试剂比较贵。

第一法修改的Marklund方法（一）定义：25℃时抑制邻苯三酚紫阳花速率50%时所需要的SOD量为一个活力单位。

（二）原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可以根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。

（三）A液：pH 8.20 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）—盐酸缓冲溶液（内含1mol/LEDTA-Na2）。

称取1.2114g Tris和37.2mgEDTA-Na2溶于62.4mL0.1mol/LHCl溶液中，用蒸馏水定容至100mL.B液：4. 5 mmol/I.邻苯三酚盐酸溶液。

称取邻苯三酚(A.R)56.7 mg溶于少量10 mmol/I.盐酸溶液，并定容至10D mL。

10mmol/L 盐酸溶液；0.200mg/mL超氧化物歧化酶；蒸馏水；二重石英蒸馏水。

（四）仪器设备紫外-可见分光光度计；精密酸度计（精确度0.01pH）;离心机；10mL比色管；10mL离心管；玻璃乳钵。

（五）试样的制备1、固体样品(茶、花粉等)称取1.00 g样品置于玻璃乳钵中，加入9. 0 mI.蒸馏水研磨5 min, 移入10mL离心管。

用少量蒸馏水冲洗乳钵，洗涤并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000 r/min离心15min，取上清液测定。

2、澄清液体样品可取原液直接测定，浑浊液体样品经4000r/min离心15min, 再取上清液测定。

（六）分析步骤1、邻苯三酚自氧化速率测定再25℃左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL,蒸馏水2.00 mL, B液0.15 mL。

加入B液立即混合并倾人比色皿，分别测定在325 nm波长条件下初始时和1 min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率∆A325（min-1）。

实验25-氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：本反应产物H2 O2 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻或小麦叶片。

（二）仪器设备高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支。

（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。

（5）20 µmol/L核黄素溶液称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。

三、实验步骤1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取1.5－2ml于4000r/min 下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

2、显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。