植物显微技术实验参考资料

实验一植物根尖染色体压片法

一、实验目的

1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法；

2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。

二、实验原理

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织（分生区），其中根尖是最常用的材料：

1. 根尖取材容易，操作和鉴定也比其它组织方便；

2. 采用实验室内种子萌发后所长出的幼嫩根尖，不受植物生长季节的限制，并且可以大量获得；

3. 对于某些珍贵而稀少的实验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材

料的伤害要小得多；

4. 采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。

三、实验材料

•大蒜（Aillum sativum 2n=16）

四、实验器具和药品

1. 用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。

2. 药品：无水酒精，70%酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石炭酸，甲

醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。

五、实验说明

1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。

2. 植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。

3. 有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。（预处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理3-4小时。常用的药剂，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。）

4.植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁将分生细胞结合成

一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。

六、实验步骤

1.前处理：将大蒜或洋葱的鳞茎，置于盛水的小烧杯上，放在25℃温箱中，待要长到2cm左右时，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱和水溶液，或0.02%秋水仙素溶液中，浸泡处理3-4小时。

2.固定：经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中，固定24小时。固定材料可以转入70%酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。

3. 酸解：从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1mol/L HC中，在60℃水浴中，解离8-10分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板上，加上几滴改良石炭酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。

4.压片：把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分剪去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞的附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的，必需掌握以下几点：

①压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展余地。

②敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。

5. 封片：把压好的玻片标本，放在干冰或冰箱结冰器时冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片和载玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。

七、结果拍摄根尖染色体有丝分裂中期相。

实验二去壁低渗法制备染色体标本

一、实验目的

1. 学习利用去壁低渗火焰干燥法制备植物染色体标本。

2. 获得分散良好、形态清晰的中期染色体用于核型分析。

二、实验原理

植物染色体标本制备最常用的方法是压片法，将材料解离后进行染色和压片，由于植物细胞具有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上，使用压片法进行制片时常常由于细胞堆积致使染色体很难彻底分散开。而去壁低渗法则是先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，得到原生质体，再将细胞进行低渗处理，即把细胞置于低渗液（低浓度的KCl或蒸馏水）中，使细胞充分吸水膨胀，染色体分散，平展地铺展在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴在载玻片上。此法有效地克服了压片法中存在的染色体分散不开、平展不良等不足，现已成为当前植物染色体研究中的重要方法，广泛应用于核型分析、染色体显带等研究。

三、实验材料

大蒜根尖（染色体数2n=16）

四、实验用品：

1. 器材：显微镜；温箱；冰箱；重蒸水；眼科镊子；刀片；牙签；载玻片；试剂瓶；三角瓶；量筒；酒精灯；青霉素小瓶

2. 药品：

①0.2% 秋水仙素溶液

②Giemsa原液

③甲醇（AR级以上）

④冰醋酸（AR级以上）

五、实验步骤

1.取材：将大蒜瓣掰开，大头朝下置于白瓷盘中，加上少许水，3-4天后根长到1cm左右，将根剪下，用蒸馏水洗几次。

2.预处理：根尖用0.2%的秋水仙素溶液处理2～4h。

3. 前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯化钾低渗液中，在25℃条件下处理30分钟。以下可分两种方法进行处理:

第一种方法：

①酶解去壁：吸去氯化钾溶液，加入混合酶液（2ml滴管5滴左右），在25℃下处理1-2小时。

②后低渗：吸去酶液，慢慢加入(25±0.5) ℃的双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10-30分钟第二种方法：

①固定：吸去前低渗液，立即加入甲醇：冰醋酸（3：1）固定20-30min

②水洗：将固定好的材料用蒸馏水洗三次，除去材料中的固定液

③酶解去壁：在小瓶内加入混合酶液（酶液量以浸过材料为合适），在25℃下酶解30-60min。

④后低渗：同上，但是，可适当延长时间至1-1.5小时。

4. 经过上述两种方法处理的材料,可用两种方法制备染色体标本

第一种方法——涂片法:

①固定：经后低渗的材料，直接用甲醇：冰醋酸（3：1）固定30min上

②涂片：将材料放在预先用蒸馏水浸泡并冷冻的清洁载玻片上，加1滴固定液，然后用镊子迅速将材料夹碎涂布，并去掉大块组织残渣

③火焰干燥：立即将载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干

④染色：经干燥的玻片标本，用Giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水细流冲洗，甩干水珠空气干燥。

第二种方法——悬液法：

①制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液；

②固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液1-2ml，使成细胞悬液；

③去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层悬液于另一个小瓶中；

④去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上清夜，留约

0.5ml左右细胞悬液置备标本；

⑤标本制备：在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用吸管滴2-3滴细