细胞克隆形成率实验

大鼠牙髓干细胞的分离培养与鉴定

大鼠牙髓干细胞的分离培养与鉴定陈婉;甘春兰;赵文青;吴煜;蔡捷【摘要】目的:分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定.方法:采用酶消化法分离获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法纯化细胞,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,抗波形丝蛋白及角蛋白、抗STRO-1免疫化学染色.体外分化诱导实验检测细胞的多向分化能力.结果:分离纯化获得的大鼠牙髓干细胞在体外具有一定的克隆形成能力,波形丝蛋白、STRO-1均有表达.诱导条件下部分牙髓干细胞具有多向分化的潜力,符合干细胞特征.结论:成功从大鼠牙髓中获取牙髓干细胞.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)006【总页数】5页(P901-905)【关键词】大鼠牙髓干细胞;细胞克隆;免疫化学;诱导分化【作者】陈婉;甘春兰;赵文青;吴煜;蔡捷【作者单位】广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学医学科学实验中心【正文语种】中文【中图分类】R-33目前研究已证明，许多组织器官的更新都是通过干细胞来维持的，当牙齿受到酸蚀、龋坏或机械损伤时，成牙本质细胞受到破坏, 牙髓组织可以形成修复性牙本质以保护受损牙齿，说明牙髓组织中可能含有牙髓干细胞。

2000 年Gronthos 等[1，2]首次提出牙髓干细胞的概念，并证明其具有生成牙髓牙本质样复合物的能力，可分化为功能性的成牙本质细胞，形成牙本质。

Miura 等[3]于 2003 年首次在脱落的人类乳牙中也发现了多潜能干细胞，为牙髓干细胞的研究开辟了一个新的领域。

本实验以大鼠牙牙髓为研究对象，采用酶消化分离法并加入有限稀释法，获得纯化的大鼠牙髓干细胞，并对其生物学特性及多向分化能力进行研究，为今后的牙髓干细胞相关研究奠定基础。

1 材料和方法1.1 实验动物：选取健康2个月龄Wistar大鼠，均为雄性，体重为(250±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供。

软琼脂克隆形成实验

➢ 配制含20%FBS、2X双抗PS的2X1640培养基，用0.2微米的滤器过滤除菌。
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。
THANKS
Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验

克隆形成实验

克隆形成实验
克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的常用方法之一。

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆，其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类。

平板克隆即细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞；软琼脂克隆即细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

细胞集落形成实验

细胞集落形成实验方法介绍非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。

纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。

原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。

细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。

集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%（一）原理细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。

每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。

集落形成率表示细胞独立生存能力。

常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。

（二）实验用品1.材料：Hela细胞。

2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。

3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。

（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。

(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。

(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。

细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。

(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。

一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。

(4)培养皿置 37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。

(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。

甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。

软琼脂集落形成实验

1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。

把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。

2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm 含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在35 mm的平皿中长至70％～80％铺满，然后与20 μμmol·I-1的AS －ODN。

共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制6mL·L-1的底层琼脂，lml／孔加入24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL·L-1的琼脂混合，以每孔0.5 mL中含500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。

应用极限稀释细胞克隆形成实验方法检测血清活力

１ｔｒｍｔｇａｅｔｅｖｌｅａ１— ，ｎｉｄｉｖｒｅｍｓｏｓｔｎｙｇｏｐｉｂｕｕｅｆｌｉｎｌ，ｈａｓ３ａｄｊｎｓｅａｓｒｎｉｅｃｒｕｓｔａｏｔｄｏａｉｉｖｕｕｗｏｅｎｅｌｕｃｓｗｈ
ｃｌｕａｅｕｙｐｉｓｏｕｃｉｎｗｉａｅｃｕｔｏｌｎｎｅａｉｅｕｉ．ＲｅｕｔＦｏｒｂｔｈｓｒｍｓａｃｌｔｄｏｔｂｏｓｉｎｆｎｔｔｔｋｏｎｆｃｏｉｇｎｇｔｎｔｏｈｖｓｓｌｓｕａｃｅｕｗｅｅｔｓｅｙＬｃｌｓｃｏｅｆｒｉｇａｓｙ．ＴｈｅｕｔｌａｌｒｅｔｄｂＤｅｌｌｎｏｎｓａｍｅｒｓｌｃｅｒｙ，ｔｅｓｒｍｃｉｉａｅｏｓｈｅｕａｔｔｇｄｆＦＢＳ一１，ｖｙｒ
ｔｅｓｒｍｃｉｉｒｖｌａｅｙｔｅｅｍｉａｉｎｏａｃｅｕ．ＭｅｈｄｓＴｅｔｓｅｅｌｉｈｅｕａｔｖｔｗｅｅｅａｕｔｄｂｈｅｄｔｒｎｔｏｆ４ｂｔｈｓｒｍｓｙｔｏｈｅｔｄｃｌｓｄ．
ＬＤｅｌｌｎｏｍｉｇａｓｙｉｔｃｉｇｓｒｍｔｖｔｃｌｓｃｏｅｆｒｎｓａｎｄｅｅｔｎｅｕａｃｉｉｙＤＵａｎｘｎＺＨＡＯｉｗｅＹＬｉ — ｉＨｕ．ｎ，Ｕ ∞ ．
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ｆｉＨｎｎＰｏｉｉｓｔｔｏｐｔａｍｌｙＺｅｇｈｕ４００，ｈｎｅｅａｒｖｃｌｎｔｕｅｆＯｈｈｌｏｏ，ｈｎｚｏ５０３Ｃｉ．ｎａＩｉｇａ

细胞克隆形成实验注意事项

细胞克隆形成实验注意事项细胞克隆是一种重要的实验技术，可以用来研究细胞生物学、疾病发生机理、药物筛选等方面。

然而，进行细胞克隆实验时需要注意一些细节，以确保实验的准确性和可重复性。

以下是一些细胞克隆形成实验的注意事项。

一、实验前的准备工作1.准备培养基和培养皿选择适合细胞生长的培养基，并在实验前将其预热至37°C。

同时，清洁和消毒培养皿，避免细菌和真菌的污染。

2.校准培养条件保持培养室和实验室的温度、湿度和CO2浓度在适宜值，可以通过温度计、湿度计和CO2计进行监测和校准。

3.准备细胞悬液将需要克隆的细胞悬液均匀搅拌，确保细胞的均一性和活力。

4.准备实验仪器和试剂根据实验需要准备好显微镜、离心机、培养箱、培养皿等仪器，以及细胞传代所需的酶解液、胰酶等试剂。

二、细胞传代前的操作1.检查细胞形态在进行细胞传代前，用显微镜观察细胞的形态和数量，确认细胞悬液的质量和纯度，避免由于细胞的老化或污染导致实验结果的不准确。

2.离心分离细胞将细胞悬液离心分离，去除培养基和杂质，以保证下一代细胞的生长环境和纯度。

3.酶解细胞使用合适的酶解液和酶，对细胞进行酶解，以分离细胞并保持其活力。

4.计数细胞用血细胞计数板或细胞计数仪对酶解后的细胞悬液进行计数，确保每一次传代的细胞数量精确。

5.调整细胞密度根据实验需要，调整细胞的密度，使之适合于进行克隆实验。

三、细胞克隆实验中的注意事项1.选择合适的细胞密度在进行细胞克隆实验时，要保证每个克隆在培养皿中有足够的空间，避免细胞之间的相互影响和竞争。

2.设计合理的对照组在进行细胞克隆实验时，要设计好对照组，以便比较实验组和对照组之间的差异。

3.查看细胞生长状态在进行细胞克隆实验过程中，经常观察和记录细胞的生长状态，包括形态、数量和分化情况等，及时发现并解决问题。

4.避免细菌和真菌污染在进行细胞克隆实验时，要保持实验环境的清洁和消毒，避免细菌和真菌的污染，影响实验结果的准确性。

软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。

细胞一定要分散得好，不克不及有细胞团，接种密度不克不及过大。

软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系。

接种细胞的密度每平方厘米不超出35个，正常细胞在悬浮状态下不克不及增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。

2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。

提前融化血清和双抗。

3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解 1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中坚持。

4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。

5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不克不及发生气泡）。

对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。

每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。

7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中坚持。

克隆形成实验原理及步骤

克隆形成实验原理及步骤嘿，咱今儿就来讲讲克隆形成实验的那些事儿！你知道吗，这克隆形成实验就像是一场细胞的奇妙冒险之旅。

先来说说原理哈。

这就好比是让细胞们去参加一场“克隆大赛”，看谁能繁衍出最多的“子孙后代”。

细胞们在合适的环境里，就会开始分裂、增殖，形成一个个小小的克隆群体。

这就像是星星之火，可以燎原一样，一个小小的细胞也能发展成一大片呢！那具体步骤是咋样的呢？首先得准备好细胞啦，就像给运动员们准备好比赛场地一样。

把细胞小心翼翼地种在培养皿里，给它们提供舒适的“家”。

然后呢，就是耐心等待啦，看着它们一点点地生长、分裂。

这过程可不简单哦，就像看着小树苗慢慢长大，得时刻关注着，可不能出啥岔子。

接着，经过一段时间后，就可以看到培养皿里出现了一个个的小克隆啦！哇，那感觉就像是看到自己精心培育的花朵终于绽放了一样惊喜。

这时候，就得给这些小克隆们“拍照留念”啦，用合适的方法把它们标记出来，记录下它们的样子和数量。

你说这是不是很神奇？就这么一个小小的实验，能让我们看到细胞的强大生命力和繁殖能力。

这就像是打开了一扇通往微观世界的大门，让我们对生命的奥秘有了更深的了解。

想想看，如果没有这样的实验，我们怎么能知道细胞是怎么工作的呢？怎么能找到治疗疾病的新方法呢？所以说啊，这克隆形成实验可真是太重要啦！在做这个实验的时候，可得细心再细心哦，就像照顾小宝宝一样，不能有一点马虎。

每一个步骤都得做到位，不然可就得不到准确的结果啦。

这就好比搭积木，一块没放好，可能整个城堡就垮啦！总之呢，克隆形成实验是生物学研究中非常重要的一部分。

它让我们能更好地了解细胞的特性和行为，为医学、生物学等领域的发展做出贡献。

所以啊，大家可得好好了解了解它，说不定哪天你也能亲自去尝试一下呢！你难道不想去探索一下这个神奇的细胞世界吗？。

细胞生物学实验Hela细胞培养

2、NaHCO3-CO2，作为常用的缓冲系统，如果培养箱中CO2浓度设定为5％，则 NaHCO3的工作浓度为2.0g/L；如果CO2浓度设定为10％，培养基中NaHCO3的工作浓度为3.7g/L。
3、酚红：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。酚红在无血清培养基时可能带来细胞内外钠/钾失衡，影响细胞生长，这种作用在有血清培养时能被血清中和或减轻。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。高级培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞贴壁的基本过程
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞的营养需要：特定的培养基和添加剂细胞的生存环境：温度: 37 ℃； CO2 、O2 ； pH: 7.2-7.4；渗透压；适宜的湿度无化学和生物污染、无毒害
CO2: 5% －10％缓冲体系： CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3HEPES
细胞生物学实验Hela细胞培养
一般说来，含5％血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需要10％的血清。对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但血清中的复杂成分至今尚未完全研究清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长的抑制因子或毒性因子，因此含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞培养所需要的溶液
添加剂：

细胞株开发中单克隆形成率的计算

细胞株开发中单克隆形成率的计算细胞株的开发是生物技术研究中常见的一项工作，而单克隆形成率则是评估细胞株开发效果的重要指标之一。

本文将对单克隆形成率的计算方法进行详细介绍，并探讨影响单克隆形成率的因素。

一、什么是单克隆形成率？单克隆形成率是指在细胞株开发过程中，成功形成单个细胞克隆的比例。

在细胞株开发过程中，通过细胞分离、培养和筛选等步骤，可以得到单个细胞的克隆。

单克隆形成率的高低直接影响到细胞株的纯度和稳定性。

二、单克隆形成率的计算方法单克隆形成率的计算方法是通过统计成功形成克隆的细胞数量与总细胞数的比值来得到的。

具体计算公式如下：单克隆形成率 = 成功形成克隆的细胞数 / 总细胞数× 100%其中，成功形成克隆的细胞数是指在细胞株开发过程中，通过细胞分离、培养和筛选等步骤，最终成功形成克隆的细胞数量；总细胞数是指细胞株开发过程中所使用的总细胞数量。

三、影响单克隆形成率的因素1. 细胞分离效果：细胞分离是细胞株开发中的第一步，分离效果直接影响到单克隆形成率。

如果细胞分离不完全或过度分离，都会降低单克隆形成率。

2. 培养条件：细胞在培养过程中需要适宜的培养基、温度、湿度和气体环境等条件来维持其正常生长和分裂。

不良的培养条件会导致细胞生长缓慢或死亡，从而影响单克隆形成率。

3. 细胞筛选方法：细胞筛选是细胞株开发中的关键步骤，常用的筛选方法有限稀稀释法、克隆形成法和细胞团聚法等。

不同的筛选方法对单克隆形成率有不同的影响，选择合适的筛选方法可以提高单克隆形成率。

4. 细胞的遗传稳定性：细胞的遗传稳定性直接影响到细胞的克隆性。

如果细胞存在遗传变异或突变，会导致细胞株不稳定，从而降低单克隆形成率。

5. 携带病原体的污染：细胞株开发过程中，如果细胞携带病原体，会导致细胞生长异常或死亡，从而影响单克隆形成率。

四、提高单克隆形成率的方法1. 优化细胞分离方法：采用适当的细胞分离方法，确保细胞的完整性和活力，提高单克隆形成率。

细胞活力检测

细胞活力检测在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力（cell viability）。

细胞活力测定方法有MTT法、克隆（集落）形成法、台盼蓝染色法、3H放射性同位素掺入法等。

其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。

但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。

为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如CCK-8（WST-8）、XTT等。

MTTMTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和配置好的溶液都需要用铝箔纸包好避光保存。

实验的时候尽量关闭超净台上的日光灯进行避光操作。

步骤如下：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔体积200ul.2：培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul. 继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

克隆形成实验

创作编号：GB8878185555334563BT9125XW创作者：凤呜大王*克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡. (3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

克隆形成实验

克隆形成实验克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

克隆形成实验

克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

克隆形成实验

克隆形成实验
在科学领域中，克隆技术一直是备受关注的话题之一。

克隆形成实验是一种重要的科学方法，通过实验过程可以获取有关生物复制和发展的重要信息。

下面将介绍克隆形成实验的基本原理和实施方法。

原理
克隆形成实验的原理主要基于生物复制过程中的细胞分裂和遗传物质传递。

在实验中，研究人员通常会选择一个成熟的细胞，将其核移植到一个去除了细胞核的受体细胞中。

这个过程类似于自然界中的受精过程，新的细胞会继续遵循原细胞的遗传信息发展成为一个克隆体。

实施方法
1.细胞采集：首先需要从一个成熟的细胞中提取细胞核。

2.受体细胞准备：准备一个去除了细胞核的受体细胞，通常为卵母细
胞。

3.细胞核移植：将第一步中提取的细胞核移植到受体细胞中。

4.培养：将形成的新细胞培养至一定阶段，确保其正常发育。

这种方法虽然看似简单，但实际操作中却需要高超的技术和精密的操作，因为任何一丝差错都可能导致实验失败。

应用与影响
克隆形成实验在生物学研究和医学领域中具有重要的应用价值。

通过克隆形成实验，科学家们可以更好地研究细胞分裂、遗传物质传递等生物基本过程，为后续的研究工作奠定基础。

此外，克隆技术还在医学领域具有潜在的应用前景，比如用于治疗某些疾病或生成器官。

总的来说，克隆形成实验是一项挑战性的科学实验，它不仅推动了生物学研究的发展，也为医学领域的创新带来了新的可能性。

在未来，随着技术的不断进步，相信克隆形成实验将会在更多领域展现出其重要性和价值。

软琼脂克隆形成实验

软琼脂克隆形成实验
基本步骤：
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
工作浓度
储存温度
杀灭细菌
penicillin
100 units/ml
-20℃
G(+) bacteria
streptomycin
100 ug/ml
-20℃
G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline
50 ug/ml
-20℃
G(+) and G(-) bacteria
gentamicin
50 ug/ml
-20℃
G(+) and G(-) bacteria ,mycoplasma
ampห้องสมุดไป่ตู้otericin B
2.5 ug/ml
-20℃
yeast and molds
nystatin
50 ug/ml
-20℃
yeast and molds
fungizone
2.5 ug/ml
-20℃
yeast and molds