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分子生物学复习题

实验一DNA 的制备

（ 1）为什么分子生物学实施时要担心EB ？

溴化乙锭（ Ethidium bromide ）是 DNA 诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致

癌性 (接触致癌 )

（ 2） DNA 加样缓冲液的用途是什么？

由于植物细胞匀浆含有多种酶类 (尤其是氧化酶类 )对 DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗

氧化剂或强还原剂 (如巯基乙醇 )以降低这些酶类的活性。

（ 3） DNA 电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？

1．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

（ 2）琼脂脂糖的浓度不同大小的 DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖浓度与 DNA分离范围

琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线状 DNA大小 /kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1

（ 4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA 的原理是什么

DNA 分子在 pH 值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA 分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA 分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA 分离。 DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，

便可测出未知片段的大小。但是当 DNA分子大小超过20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。

此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。

（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中 DNA 是靠什么发出荧光的？为什么？

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入 DNA 双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合

物。在 254nm 波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA ，可检出 10-9g 以上的 DNA 含量。

（ 6）制备基因组 DNA 时用到的以下试剂分别起什么作用？

CTAB 等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA 得以游离出来

氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中，即得植物总 DNA 溶液。

75%乙醇 ,乙醇轻轻洗涤管壁

实验二RNA 的制备

1.制备 RNA 时通常要注意些什么？为什么？

应该要注意 (1) 不要徒手操作 , 必须带手套 ;(2) 加样时不能够大声说话, 防止唾液等进入 ;

由于 RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在

提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。

2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化

质粒 DNA 构建克隆载体 ,分离目的基因

RNA 。

3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？

1.2% 琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，其中 28S rRNA 条带的亮度应该为18SrRNA

完整的总 RNA 样品应呈现三条带：28S、18S、和 5S rRNA 。条带的 1.5~2 倍。反之，说明部分28S rRNA 已经降解成18S

rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA 污染。

4.RNA制备好后通过什么方法测定其含量？

RNA 通常用分光光度计测量，通常在

的浓度为40 微克 /ml

A260的读书在0.15-1.0之间才是可靠的，A260为1 相当于RNA

实验三质粒DNA的制备

1.什么是质粒？质粒有什么主要用途？

染色体外小型（1-200kb ）的共价、闭合、环状的双链DNA 分子（ cccDNA ），能自主复制并能稳定遗传

的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限

制酶、修饰酶等

用途 :把一个有用的目的DNA 片段通过重组 DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具

叫载体 (Vector) 。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

2.分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

1 环状 DNA 分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。

2 有多个限制酶切点(便于切割 )

3 有标记基因 (便于进行检验)

3.制备的质粒DNA 在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？

DNA 其转化或转染效率最高？

哪种条带形式的质粒

三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。

实验四感受态细菌的制备及质粒DNA 的转化

（ 1）什么是感受态细菌？感受态细菌的主要用途是什么？

感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源

感受态细菌吸收异源DNA分子，使受体细胞获得新的遗传性状.

DNA分子通过时细胞的状态。

（ 2）什么是转化？转化与转染的主要区别是什么？

转化（ transformation) 感受态细菌捕获质粒转染（ transfection)细菌捕获噬菌体DNA

DNA

的过程

的过程

（ 3）有哪些主要因素决定质粒DNA 的转化效率？

1.细菌的生长状态和密度：OD006=0.3~0.5细菌出于对数期或者对数前期

2.质粒 DNA ：

数量：质粒DNA 不超过感受态细胞体积的5%

大小：分子量越大转化效率越低，超过30Kb 的质粒 DNA 很难转化成功

构型：超螺旋的DNA 具有较高的转化效率，重组DNA 效率低一些，环状

效率高一些

DNA相比线性DNA转化

3.所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度

4.防止杂菌和其他外源DNA 的污染

（4）质粒 DNA 的转化过程可分为哪几个阶段？每个阶段中主要发生了什么事件？

1 吸附阶段：完整的双链 DNA 分子吸附于感受态细胞表面。