1 植物基因克隆方法
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
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1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
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3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术植物生物技术的快速发展为人们改良和改造植物基因提供了广阔的空间。
基因克隆和基因工程技术成为植物生物技术中的两个重要方面。
本文将以“植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术”为题，探讨这两个方面的内容。
一、基因克隆基因克隆是指通过复制和扩增DNA序列，从而制备大量相同DNA分子的过程。
基因克隆是植物生物技术中最早也是最常用的技术之一。
1. PCR技术PCR技术（聚合酶链反应）是一种能够扩增DNA片段的方法，它可以制备大量具有相同DNA序列的片段。
在基因克隆中，PCR技术被广泛应用于检测和扩增目标基因，为基因工程技术的开展提供了基础。
2. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
基因克隆中，通过选择性地使用限制性内切酶来切割DNA，将目标基因从其它无关基因中分离出来，实现基因的纯化与提取。
3. DNA连接DNA连接是将经过切割的DNA分子重新连接起来的过程。
连接后的DNA可以通过转化等方法引导其进入植物细胞，实现外源基因的导入。
二、基因工程技术基因工程技术是通过直接改变植物基因组中的DNA序列，对植物基因进行修改和调控的技术。
它在改良植物性状、提高植物品质等方面具有广泛应用价值。
1. 基因转化基因转化是指将外源基因导入植物细胞并使其稳定表达的过程。
通过选择合适的基因载体和转化方法，将目标基因导入植物细胞的染色体中，实现基因的稳定遗传。
2. 基因编辑基因编辑是指直接对植物基因组中特定基因进行修改和编辑的技术。
通过CRISPR/Cas9等工具，可以对植物基因组中的目标位点进行特定的编辑，实现基因的精确调控。
3. 基因沉默基因沉默是通过RNA干扰等方法，对特定基因的转录或翻译进行抑制的过程。
通过基因沉默技术，可以实现对植物性状的精确调控，提高植物产量和抗病能力等。
三、植物生物技术的应用前景基因克隆和基因工程技术在植物生物技术中的应用前景巨大。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤植物基因的克隆08医用二班姚桂鹏0807508245简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法Plant gene cloningIntroductionCloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes meansbased on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. KeywordsPlant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
基因工程 植物基因的克隆与转化_1_植物基因克隆的方法简介
科技知识讲座植物基因的克隆与转化(1)植物基因克隆的方法简介李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223)生物技术是世界新技术革命的主要内容之一。
它是以生物科学为基础,利用生物体(或是生物组织、细胞及其组分如酶)的特征和功能,用分子生物学的手段,改造生物特性、培育新品种甚至设计构建具有预期性状的新物种,与工程原理相结合进行加工生产,为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。
它包括医药生物技术、农业生物技术、海洋生物技术和环境生物技术等领域。
作为生物技术领域的先导技术 基因工程近年来发展迅猛,农业上的转基因动植物研究和开发取得了一系列的突破性进展,对于解决人类面临的资源短缺、环境污染、效益衰减等问题显示出巨大的作用。
随着生物技术产业化进程的加快,正逐渐形成一批新兴的生物技术产业。
它将成为世界经济新的增长点,对于21世纪农业生产乃至人类社会生产、生活的各个方面产生全面而深刻的影响。
基因工程育种不仅能够把各种来源的基因转化到农作物中,还可以重绘许多作物的遗传蓝图,并改变代谢途径或方向。
基因工程育种的前提和条件是必需克隆大量可供利用的功能基因。
基因的克隆就是利用DNA体外重组技术,将特定的基因从染色体上分离出来,插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整序列,确定该基因在染色体上的位置,进一步研究该基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。
由于植物的基因组非常巨大,在遗传背景不很清楚的情况下,要从庞大的基因群体中分离出目的基因不是一件容易的事。
近年来,由于生物化学、酶学、分子遗传等学科的迅速发展,为基因的分离奠定了良好的基础,并提供了有效的手段。
在农业生物技术领域,人们利用以前掌握的大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,已经从植物、动物、微生物中克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、育性、淀粉、蛋白质、脂肪及与植物生长发育有关的许多基因。
植物的克隆与繁殖方式
植物的克隆与繁殖方式植物的克隆与繁殖方式是植物生命力的表现，也是植物生物学中的重要研究领域。
通过克隆与繁殖，植物可以迅速繁衍后代，适应环境变化，增强种群的竞争力和适应性。
本文将从植物克隆的定义、克隆的基本原理、植物的主要克隆方式以及植物的其他繁殖方式等方面进行探讨。
一、植物克隆的定义植物克隆是指通过非性别繁殖产生的新个体与母体具有相同的基因组合，并且不依赖于花粉和卵细胞的结合。
克隆可分为无性生殖和有性生殖两类。
无性生殖是指植物通过无性生殖器官繁殖，如植物的根茎、克隆体和萌芽等；有性生殖是指植物通过有性生殖器官如花粉和卵细胞结合繁殖。
二、克隆的基本原理植物克隆的基本原理是植物体内存在具有分裂能力的组织细胞，通过细胞分裂和器官发生的过程，可以形成独立的个体。
这些组织细胞具有相同的遗传信息，随着细胞的分裂，新的个体逐渐形成。
三、植物的主要克隆方式1.根茎克隆：根茎克隆是指植物的根部发育成为具有克隆能力的结构，从而形成新的个体。
例如，竹子的地下茎是一种常见的根茎克隆结构，它们能够长时间地存活并产生新的竹笋。
2.萌芽克隆：萌芽克隆是指植物通过侧芽或顶芽的发育形成新的个体。
例如，土豆植物的根茎部分会产生新的侧芽，这些侧芽可以长成新的土豆植株。
3.离体培养：离体培养是一种人工的植物克隆方法，通过将植物的组织切割并培养在适宜的培养基上，可以形成新的植株。
这种克隆方式常用于研究和生产中，例如繁殖珍贵的植物品种或进行基因工程实验等。
四、植物的其他繁殖方式除了克隆方式，植物还可以通过其他的繁殖方式进行生殖。
这些方式包括：1.有性生殖：有性生殖是指植物通过花粉和卵细胞的结合形成种子。
这种方式包括传粉、授粉和花粉管的生长等过程。
有性生殖能够产生具有遗传多样性的后代，提高物种的适应性。
2.孢子繁殖：孢子繁殖是植物通过孢子产生新个体的繁殖方式。
植物的孢子是通过间接发育形成新的个体，例如苔藓植物的孢子会发育成为新的苔藓植株。
五、总结植物的克隆与繁殖方式是植物生物学的重要研究内容，也是植物生存和适应环境变化的一种重要方式。
植物基因克隆的方法
植 物 基 因 克 隆 的 方 法
王 丽媛 ， 徐 明怡 ， 倪 红伟 ，
张 玉， 冷 海 南
（ 黑龙 江省科 学 院 自然与 生态研究 所 湿地与 生态保育 国家地 方联合 工程 实验室 ， 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ４ ０ ）
摘要： 基 因 克 隆技 术 是 挖 掘 新 基 因 、 分 离控 制 植 物 重 要 性 状 基
基因克隆技术在植物基因研究中的应用
基因克隆技术在植物基因研究中的应用随着科技的发展，基因克隆技术逐渐应用于植物基因研究中。
这种技术能够有效地解决一些传统方法不能解决的问题，同时也可以提高研究的效率和深度。
本文将探讨基因克隆技术在植物基因研究中的应用，并分析其优点和局限性。
一、基因克隆技术的基本原理基因克隆技术是指将一个特定DNA序列从一个生物体中分离出来，然后在另一个生物体中重新组合形成DNA序列的过程。
该技术基于DNA的双链结构和酶切、粘合、扩增等原理。
通常基因克隆技术包括以下步骤：1. DNA的酶切：将目标DNA序列用限制酶切割成适当的长度。
2. DNA的粘合：通过DNA连接酶，将酶切割的DNA片段与载体DNA连接起来。
3. 转化：将重组后的DNA序列导入到另一个生物体中。
4. 选择：筛选出带有目标DNA序列的生物体。
基因克隆技术的主要优点之一是可以准确地检测和分析DNA序列。
同时，该技术还可以用于创建DNA文库、研究基因功能、探究生物进化历史等领域。
二、植物基因克隆技术的应用1. 基因表达分析通过克隆植物基因，可以进行基因表达分析。
例如，研究人员可以通过克隆调控某一生长期的基因，来分析该基因对植物发育的影响。
同时，研究人员也可以通过克隆一些与植物生长和代谢相关的基因，来探究这些基因在植物适应环境、生长和发育的机制。
2. 基因转化基因克隆还能够用于植物基因转化。
利用基因克隆技术可以轻松地将带有感兴趣基因的载体导入到目标植物中，从而实现基因转化。
这种方法被称为农业基因工程技术。
通过转基因技术，可以使植物获得抗病、抗虫、增产等性状的改良。
3. 基因组研究基因克隆还可以帮助研究员进行植物基因组学研究，通过克隆不同的基因，可以构建出植物基因组的DNA文库，有利于深入了解植物基因组的结构和功能，为未来的基因挖掘和基因改良提供有力的支持。
三、基因克隆技术的局限性尽管基因克隆技术在植物基因研究中有很多应用，但是该技术也存在一些限制。
比如克隆DNA片段的大小限制，不同酶的切割效果不同等问题。
植物基因的图位克隆
参考内容
植物基因分离是现代植物生物学的重要研究领域，对于理解植物生长发育、抗 逆性、品质等方面具有重要意义。图位克隆技术是一种高效的植物基因分离方 法，本次演示将详细介绍图位克隆技术的原理、实验流程及应用实例。
一、图位克隆技术的原理
图位克隆技术是一种基于基因组图谱的基因分离方法。首先，通过物理作图或 遗传作图将目标基因定位到染色体上的具体位置，构建基因组图谱。然后，利 用图谱将目标基因周围的DNA片段分离出来，进行测序和分析。最后，通过生 物信息学方法和遗传学实验确定目标基因的具体序列和功能。
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植物基因的图位克隆
目录
01 引言
03 一、植物基因图位克 隆的技术原理和应用
02 主体部分 04 二、植物基因图位克
隆的实验流程和操作
目录
05 三、植物基因图位克 隆的挑战和解决方案
07 参考内容
06 结论
关键词：植物基因、图位克隆、基因功能、实验流程、挑战与解决方案
引言
随着生物技术的不断发展，对植物基因功能的研究已成为农业、生态学等领域 的重要课题。图位克隆技术作为一种前沿的基因克隆方法，已在许多植物基因 的研究中发挥重要作用。本次演示将详细介绍植物基因图位克隆的技术原理、 应用及面临的挑战和解决方案。
植物基因图位克隆的实验流程包括以下几个主要步骤：
1、样本采集：根据研究目标和实验需求，采集不同类型和不同发育阶段的植 物组织样本。
2、基因的筛选：利用生物信息学方法和基因组图谱，筛选出与目标表型特征 或生理特性相关的候选基因。
3、定位分析：对候选基因进行定位，可以通过比较基因组序列、染色体构象 信息等手段，确定目标基因在染色体上的位置。
5、功能研究：进一步研究候选基因的功能和作用机制，如通过细胞实验、模 式动物研究等手段。
植物克隆技术
植物克隆技术
植物克隆技术是指通过非性生殖方式繁殖植物，使子代与母体有相同的遗传信息。
常用的植物克隆技术有以下几种：
1. 剪接：将一段健康植物的茎或叶片插入培养基中，通过分裂再生形成新的植物。
2. 组织培养：将植物的一小段组织（如茎尖、花器官等）放入含有植物激素的培养基中，培养出新的植株。
3. 胚胎培养：从植物的胚胎中取出细胞，通过体外培养让其分化为新的植株。
4. 种子分离：通过人工处理种子，使其发育成为植株。
植物克隆技术可以用于繁殖精良的杂交品种、保存稀有植物、加速苗木生产以及修复受损环境等方面。
然而，植物克隆也存在一些问题，比如由于缺乏遗传多样性，植物容易受到疾病和逆境的侵袭。
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法seek； pursue； go/search/hanker after； crave； court； woo； go/run after植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中.基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系.通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因.我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究舒群芳等,1995;舒群芳等,1997,为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展.1 功能克隆functional Cloning功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆Collis,1995.其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,1将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,2将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆.功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略.Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因Vst1和Vst2,葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢Botrytis cinerce的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义Hain等,1985.Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析Kondo 等,1989.周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA周兆斓等,1996.植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡.胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒Cucumber Mosaic virusCMV,并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因胡天华等,1989.王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒potato virus X, pvx,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因,并将外壳蛋白基因转入马铃薯中,以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯王春香等,1991.病毒外壳蛋白Coat protein cp基因的成功克隆,可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性Coat Protein Mediated Resistance CPMR或病毒CP-RNA介导的抗性.Van kan 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9,可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物Van Kan等,1991.我们1995年构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础舒群芳等,1995;舒群芳等,1997.功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的.如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质.因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质.只要有一个纯的蛋白质,得到十分特异的探针,这一策略是行之有效的.采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因,但由于绝大多数基因的产物目前还不知道.所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆.随着分子生物学技术的发展,一条新的基因克隆策略逐渐形成,这就是定位克隆.2 定位克隆Positional cloning根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制,这样一种策略叫定位克隆Monaco,1994.连锁分析即通过基因与DNA标记之间的重组系数来估计这两者之间的距离,若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离,即有连锁在一起的趋势.根据这一原理可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位.由于连锁分析需要依赖特定的基因作为连锁标记,即标记基因与待研基因之间存在连锁关系,而满足与待研基因相连锁的基因实在太少,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难.RFLP的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难.1980年Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性RFLP restriction fragment length polymorphism,使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能.限制酶切片段长度多态性是用限制性内切酶切割后产生的DNA片段长度的多态性呈孟德尔式遗传,是存在于全基因组的独特的多态标记,RFLP使基因定位变得易行Wyman 等,1980.目前定位克隆一般是用RFLP等分子标记制作遗传图谱,寻找与待测基因连锁的RFLP标记,获得基因在染色体上的定位然后克隆基因.所以RFLP和后来发展起来的RAPD技术的建立,可将待测基因相对准确地定位,利用已知的基因可分离与之连锁的未知基因.其基本程序是构建一个基因组文库、用已知的A基因为探针,从基因组文库中筛选出与其有同源序列的a克隆,再用a克隆为探针从基因组文库中筛选出与a克隆有同源序列的b克隆,然后以此类推最后筛选出未知基因并把它分离出来.目前已在番茄、烟草、大麦、水稻、大豆、玉米等植物中发现了与抗病基因紧密连锁的RFLP标记并构建了遗传图谱Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith,1991;Diers等,1992.用这种方法已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因Martin等,1993;Bent等,1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995 .Martin等1993年最早用定位克隆技术克隆出番茄pto基因,pto基因负责对带有无毒基因Avrpto的细菌,丁香假单胞菌pseudomonas syringae pv菌株的抗性,Pto基因导入感病番茄后转基因植株增强了对病原菌的抗性Martin等,1993.Wenyuan等1995年用这一技术克隆了水稻Xa21基因,Xa21基因对真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae Xoo具有抗性Wenyuan 等,1995. 3 转座子标记法transposon tagging 转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段.在转座过程中原来位置的DNA片段转座子并未消失,发生转移的只是转座子的拷贝、基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因.通过转座子上的标记基因如抗药性等就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来.转座子标记法是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因Fedoroff等,1984;Jones等,1994. 利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面:1 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体.2 把转座子导入目标植物.3 利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中,这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的.4 转座子插入突变的鉴定及其分离Ellis等,1992.通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的Ac. Mu, Smp和Ds等.Ac含有编码转座酶的基因,能够自主的转座,Ds不含转座酶所以不能自主的转座,但Ds-Ac系统因Ac为Ds提供了转座酶就可以自主的转座了.用转座子标记法进行植物基因的分离,首要的是把Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中,目前多数是利用土壤农杆菌介导的转化系统把转座子导入目标植物中Keller等,1993;Bancroft等,1993.目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因Johal和Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995.Johal和Brigge分离出抗灰色长蠕孢Helminth osporium carbonum1号小种玉米的HMI特异真菌抗性基因.该基因存在于玉米的抗性品种中,能够分解长蠕孢1号小种产生的对玉米具特异致病性的HC毒素,该基因编码HC毒素脱毒酶可使植物具有抗病性Johal和Briggs,1992.和转座子标记法的原理相似的还有T-DNA标记法,两者都是由于一段基因的插入导致染色体结构发生变化产生突变体,而T-DNA标记法产生的突变是由于T-DNA插入导致的.Kenneth等利用T-DNA插入标记培育出拟南芥矮化突变体Kenneth等,1989. 4 人工合成并克隆基因蜘蛛毒素是一种小肽,它只有37个氨基酸,体外实验表明它能杀死多种对农作物有害的昆虫,蒋红等1995年根据蜘蛛毒素的氨基酸序列,采用植物偏爱密码子、人工合成并克隆了此肽的基因蒋红等,1995.Adang 1995年人工合成了苏云金杆菌毒蛋白Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein基因Adang等,1995. 5 表型克隆phenotype cloning 1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念Jonsson和Weissman,1995,有些植物目前即不了解它的基因产物,也没有对它们进行基因定位,但已知植物在表型上存在差异,利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆.San等用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因Sun等,1992.表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来,从而分离特定表型相关基因,力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位,根据基因的表达效应就直接分离该基因Brown,1994.6 mRNA差异显示mRNA differential display1993年Liang和Averboukh等科学家提出了mRNA差异显示mRNA DD, mRNA differential display的方案Liang等,1993.这一方案的依据是在高等真核生物中所有的生命过程和病理变化,不论是由单基因控制的还是由多基因控制的,最终都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来.研究基因表达差异,研究两基因组差异表达基因的分离,为克隆复杂性状相关基因开辟了重要的途径.该方案可以检测、分离出全长任何部分有突变的mRNA,其基本程序是:1提取两种细胞的mRNA,反转录后成为2种cDNA.2 以一定的引物作随机聚合酶链反应.3 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带.4将差异DNA做成探针.5 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析Baeur等,1993.Liang和Pardee又建立了mRNA差别显示PCR方法Liang和Pardee,1992,该方法可以同时分析几个样品间基因的表达,检测灵敏度高,PCR扩增后,一些表达量很低的mRNA也能被检测出来,应用PCR及DNA测序,两种技术简单易行,目前已被成功地用来分离小麦热激蛋白基因Joshi等,1996和水稻蔗糖调节基因Tseng等,1995等.7 减法杂交Subtractive hybridizationLee等1991年提出减法杂交技术Lee等,1991,植物在生长发育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段,由于基因特异性的表达,其mRNA表现不同,这样从表达特异基因的组织中提取 mRNA,反转录为cDNA,从无特异基因表达的组织中提取mRNA,两者杂交,在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子,而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态,把这种单链cDNA 分离出来即为差异表达的基因,Chong等用此技术克隆了小麦春化相关基因Chong等,1994.8 PCR扩增克隆这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法.目前已经知道了很多植物基因的序列,当克隆类似基因时可先从Gene bank库中找到有关基因序列,用PCR方法克隆不同植物的基因.基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物,从植物中提取DNA进行PCR扩增,扩增的片段纯化后连接到合适的载体上,用酶切分析和序列分析检测重组子,并与已知基因序列进行比较,如目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨酸的蛋白及其编码基因,根据Masumura等1989发表的10KD水稻醇溶蛋白基因序列合成一对引物,王广立等克隆了水稻10KD醇溶蛋白基因王广立等,1994.9 依据序列同源性克隆基因生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列.此方法的基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的前提下,构建cDNA文库或基因组文库,然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆.马德钦等根据文献报道的甜菜碱醛脱氢酶BADH基因的序列作了菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析马德钦等,1996.综上所述,可见发现和克隆基因的过程是艰巨和富有收获的,几十年来各国科学家在基因克隆这一最激动人心的生物高技术领域内走过了艰难而又曲折的历程,从而创造和发展了上述种种植物基因克隆的方法,使人类在认识自然、掌握自然的道路上又前进了一步.前辈所创造的成就和技术无疑为我们成功地克隆植物基因提供了快捷和高效的途径.利用已知序列克隆基因,用同种或同属的已知的同源序列筛选基因都比较容易,适合于克隆那些研究较晚的许多重要农作物的基因.获得极纯的蛋白质是功能克隆的关键,随着蛋白质纯化技术的提高,功能克隆将发挥它的潜在作用.随着植物遗传图谱上基因定位基础研究工作的提高,定位克隆将发挥其巨大的作用. 作者单位：舒群芳李文彬孙勇如中国科学院遗传研究所北京100101赵路首都师范大学化学系北京100037。
植物基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习植物基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握PCR扩增、酶切、连接、转化等基因克隆技术，并验证克隆基因的正确性。
二、实验原理植物基因克隆是通过PCR扩增目的基因片段，然后将其插入到载体中，构建重组质粒，再通过转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子。
本实验采用PCR扩增目的基因片段，再通过酶切、连接等步骤将其插入到载体中。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 植物DNA模板- 引物- 载体DNA- 宿主细胞（如大肠杆菌）- 转化试剂（如CaCl2）2. 实验试剂：- DNA聚合酶- 限制性内切酶- DNA连接酶- T4 DNA连接酶缓冲液- DNA分子量标准- 水浴加热器- PCR仪- 电泳仪- 显微镜四、实验步骤1. PCR扩增目的基因片段- 配制PCR反应体系，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶等。
- 将PCR反应体系置于PCR仪中，进行PCR扩增。
- PCR扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2. 酶切和连接- 将PCR扩增产物和载体DNA进行酶切，酶切位点应与目的基因片段的上下游序列相匹配。
- 将酶切后的目的基因片段和载体连接，加入DNA连接酶和连接缓冲液。
- 将连接产物置于水浴加热器中，进行连接反应。
3. 转化宿主细胞- 将连接产物与宿主细胞混合，加入转化试剂（如CaCl2）。
- 将混合物置于冰浴中，使细胞吸收连接产物。
- 在适当的温度下，将细胞培养一段时间，使其吸收连接产物并表达目的基因。
4. 筛选转化子- 将转化后的细胞涂布于含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转化子。
- 将转化子进行PCR扩增，检测目的基因的存在。
5. 验证克隆基因的正确性- 将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，验证克隆基因的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因片段大小与预期相符。
2. 酶切和连接产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因片段与载体连接成功。
植物基因克隆实验总结
2015-2016第二学期生物科学实验（植物基因克隆）实验总结班级：13级生物科学2班学号：1312022005 姓名：邓伟强日期：2016年6月10日一、实验原理及方法：实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。
通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
实验方法及过程：1. CTAB法提取水稻基因组DNA配制CTAB溶液：(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：（24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.）2. 配置琼脂糖缓冲液：10×TBE Buffer配制方法：每组需要：称量下列试剂，置于1 L烧杯中Tris：108 gNa2EDTA·2H2O：7.44 g硼酸：55 g向烧杯中加入约800 ml的无菌水，充分搅拌溶解。
加无菌水将溶液定容至1 L后，室温保存。
用时稀释。
3. 开发设计引物LOC_Os02g42310Chromosome 2: 25,442,875-25,450,093OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressedOryza sativa JaponicaGCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa IndicaGCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa JaponicaGCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAA TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA TOryza sativa IndicaGCGCCGGAGACGAAGA-----------------A TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA TOLIGO start len tm gc%any3'seqLEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTC RIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTTLength：201 japonica, 193 Indica4. PCR反应体系10×扩增缓冲液：每管：2 ul 共需：24uldNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6ul模板DNA ：每管3 ul，共需36ulTaq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul引物1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。
植物基因克隆的方法
4、目的区域的精细作图
通过整合已有的遗传图谱和寻找新的分 子标记，提高目的基因区域遗传图谱和物 理图谱的密度。
5、目的基因的精确定位和染色体登陆
利用侧翼分子标记分析和混合样品作 图精确定位目的基因。接着以目的基因两 侧的分子标记为探针通过染色体登陆获得 含有目的基因的阳性克隆。
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或这一特性可分 离一些基因,如来自蛋白激酶基因和葡萄糖载 体基因等.利用此法分离基因需做大量的转 化工作,且转化细胞中突变体频率较低.
例子
1、分离纯化了黄瓜花叶病毒、马铃薯x病毒 等，并克隆了编码这些病毒外壳蛋白的 cDNA基因。
◆ cDNA测序法只能分离特定时空下表 达的基因,且不能分析基因内和基因间的 调控序列,克隆出的新基因的功能也有待 鉴定.
人工合成并克隆基因
方法：根据已知的氨基酸或核苷酸序列，采
用植物偏爱的密码子，人工合成并克 隆该基因。（可对基因进行改造）
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人工合
成并克隆了此肽的基因。 人工合成Bt基因。
素合成酶基因。
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
analysis）
抑制性扣除杂交（suppression subtractive hybridization）
局限性：
表型克隆技术普遍存在着依赖于 PCR技术、重复性较差、加阳性率高、 对实验材料要求较高、材料间不能存 在过多的差异，结果不便确证等缺点。
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建议解决方法： 优化镁离子浓度。
5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。
RACE PCR
PCR和细胞内DNA复制的相同点：
（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离
a
b
建库法
cDNA Library
• 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真 核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因 此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA 反转录成cDNA。
• 该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2 个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游 引物，称3’-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出 polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又 设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR 扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表 一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某 种细胞类型 structure
Promoter region Core promoter
● -75 -25 0 ATG
DNA 结合蛋白
转录因子的两个主要结构域：
a. DNA结合域 -DNA binding domain，简称DNA-BD，它可
识别效应基因上游的一段特定的区段， 即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之结合。
Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 22 2 1
(16 species)
p176
Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 26 42
(1152 species)
RT-PCR and RACE PCR
Reverse Transcription,
Rapid Amplification of cDNA Ends
建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变
性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃ ，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应 温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应 温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离
5、信号传递蛋白基因的分离 6、图位克隆技术（Map-based cloning）
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
Antibody production Construction of Expression Library
算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。 9）富含GC的模板
建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx
Enhancer Solution。
问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 原因： 1）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退 火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 2）引物设计较差 避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转 录因子通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调 控蛋白相互作用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂 交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。
• GAL4的DNA结合域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳 糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或 转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中， DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我 们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们 想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域 激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
● 利用protein测序的氨基酸信息
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
6）PCR引物设计较差
建议解决方法： 避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形
成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 7）镁离子浓度太低
建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应
，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
8）退火温度太高
建议解决方法： 把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为公式估
（2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对
原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高
PCR和细胞内DNA复制的不同点：• 从基因的功能上看可分为克隆及表达。
• 克隆由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择 标记，可通过细菌具有控 制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在 宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白 表达载体及天然蛋白表达载体之分。
• 正是基于这一理的报告质粒。
• 首先将报告质粒整合入酵母基因半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
b. 转录激活域 -Transcriptional activation domain，简称AD，
它通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分 的结合作用，启动UAS下游的基因进行转录。
酵母单杂交 Yeast one-hybrid system
• 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细 胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基 因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结 合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析. 运用此技术，能 筛复杂的蛋白质分离纯化 操作 。
植物基因克隆方法
隋娜 山东师范大学生命科学学院
• 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、
连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形 成大量子代分子的过程。
• 二、基因克隆的核心---体外重组 (Recombination) 人工将一段目的DNA插入一 个载体的过程。
（二）未知 Gene products 的基因分离
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离 5、信号传递蛋白基因的分离 6、图位克隆技术（Map-based cloning）
• 将 差 别 表 达 条 带 中 的 DNA 回 收 ， 扩 增 至 所 需 含 量 ， 进 行 Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条 带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因 。
mRNA 差异显示 ( differential display)
表 达 文 库 法
PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成
可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合
酶一般不耐热 （7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的 （8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
（一）已知 基因产物ห้องสมุดไป่ตู้的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基库
● 同源(homologous)DNA探针
为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。
● 异源(Heterologous)DNA探针
基因克隆的路线
载体DNA （vector）
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等