REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

作者：周礼红，陈平，赵永霞，等

来源：《湖北农业科学》 2012年第18期

周礼红，陈平，赵永霞，荆雯雯，李祝，葛永仪

（贵州大学生命科学学院，贵阳５５００２５）

摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ＲＥＭＩ）技术介导的红曲霉（Ｍｏｎａｓｃ

ｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素B作为抗性筛选标记，ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１作为转化质粒，采用ＲＥＭＩ技术转化红曲霉。结果表明，用ＲＥＭＩ技

术介导红曲霉转化时，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３适合于红曲霉的转化。环状

质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ＲＥＭＩ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时，每微克质粒可获得的潮霉素Ｂ抗性

转化子为２８００～３２００个；ＨｉｎｄⅢ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０Ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μＬ时转化率最高。

关键词：红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（REMI）

中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4129-

05

限制性内切酶介导的整合（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＤＮＡ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ＲＥＭＩ）技术是将ＤＮＡ转化进入真核细胞，并产生非同源

整合的一种方法。ＲＥＭＩ的非同源整合机理与非同源末端连接（Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕ

ｓｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）相关［１－４］，整合的过程［５］可简单归结为三步：首先在转化过程中使线性化ＤＮＡ的酶随线性化ＤＮＡ进入核内；第二，限制性内切酶在

特定识别位点酶切宿主染色体ＤＮＡ；第三，染色体ＤＮＡ和转化片段在体内互补末端连接产

生非同源整合事件。

１９９１年Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次将ＲＥＭＩ技术应用于极易同源整合的Ｓａｃ

ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。Ｋｕｓｐａ等［７］首先将ＲＥＭＩ技术应用于Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆发育基因，构建了ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ（限制性片段长度多态性）图谱［８，９］，并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究

变得更加容易。应用该方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子［５］。ＲＥＭＩ技术还成

功应用于子囊菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ［１１］、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遗传互补分析，以及启动子捕获等。

研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切缓冲液和不同质粒对转化

率的影响，同时优化了酶的用量、受体细胞浓度等条件。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌株、质粒与培养基菌株Ｍ７５７７是野生型红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ

ａｎｋａ），由贵州大学真菌资源研究所分离、保存。

用于遗传转化的质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ由法国Ｓｉｌａｒ教授惠赠，该质粒携带潮霉素

Ｂ抗性基因（ｈｐｈ）［１３］，是用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶切线性化的。

质粒ｐＡＮ７－１［１４］带有来自Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｇｐｄ基因的启动子和ｔｒｐＣ基因［１５］的终止子。用ＨｐｈⅠ酶切质粒ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补平末端，再用ＢａｍＨⅠ酶切得到１．１ｋｂｈｐｈ基因片段（ｈｐｈ基因缺失了不影响酶功

能的前３个密码子）［１６］，与Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ带有起始密码子ＡＴＧ的ｇｐｄ基

因５′端融合；ｈｐｈ基因下游密码子区域与Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓｔｒｐＣ基因末端区域

的ＨｐｈⅠ－ＢａｍＨⅠ片段融合，克隆到质粒ｐＡＮ５２－１（克隆前先用ＮｃｏⅠ酶切ｐ

ＡＮ５２－１，用Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补平末端，再用ＢａｍＨＩ酶切）上构建得到ｐＡＮ７－１。

质粒ｐＣＢ１００３带有来自ｐＣＳＮ４３［１７］的２．４ｋｂＳａｌⅠ片段（含有

潮霉素Ｂ抗性基因ｈｐｈ和来自Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｔｒｐＣ启动子和终止子），通过单个碱基的改良消除了ｈｐｈ基因中的４个限制性内切酶位点：ＥｃｏＲⅠ（ＧＡＧＴＴＣ）、

ＰｓｔⅠ（ＣＴＧＧＡＧ）、ＳｓｔⅡ（ＣＣＧＣＧＣ）和ＢａｍＨＩ（ＧＧＴＴＣＣ），

但ｈｐｈ基因编码的氨基酸序列未变。通过ＰＣＲ技术消除ｔｒｐＣ终止子，获得了１．４ｋｂ的片段，并在片段两端引入ＥｃｏＲⅠ、ＳａｌⅠ和ＨｐａⅠ位点，最后通过ＥｃｏＲⅠ位

点亚克隆到ｐＵＣ１９构建得到ｐＣＢ１００３。

菌丝生长的ＣＭ培养基和产孢培养基按文献［１８］配制，原生质体再生液体和固体培养

基是分别于ＣＭ液体和琼脂糖固体培养基中加入蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／Ｌ；复苏液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基中加蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／Ｌ。

１．１．２药品与试剂各种限制性内切酶和ｐｆｕＤＮＡ聚合酶为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｌｙｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅ购于Ｓｉｇｍａ公司，Ｓｎａｉｌａｓｅ购于华美生物工程公司，琼脂糖购于Ｂｉｏｗｅｓｔ公司，质粒中量制备试剂盒为

德国Ｑｉａｇｅｎ公司产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。

电击转化缓冲液Ⅰ含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６００

ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ＬＬｉＡｃ，用于不含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液Ⅱ含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６００ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ＬＬｉＡｃ、３００ｇ／Ｌ聚乙二醇４０００，用于含

聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液Ⅲ含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２７０ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ＬＬｉＡｃ，用于萌

发孢子的电击转化。

ＳＴＣ溶液含有１ｍｏｌ／Ｌ山梨醇、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，ＰＴＣ溶液含有４００ｇ／Ｌ聚乙二醇４０００、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２。

１．２方法

１．２．１原生质体的制备参考文献［19］。菌株Ｍ７５７７在产孢培养基上于３０℃培养７～１０ｄ，收集孢子并制备成均一的浓度为１×１０８～１×１０９个／ｍＬ的孢子

悬液。取２００μＬ孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的ＰＤＡ平板上，于３０℃培养３０ｈ，收集菌丝体，用１ｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４溶液洗１次。约３００ｍｇ菌丝体加３０ｍＬ裂解

酶液，于３０℃以６０ｒ／ｍｉｎ酶解２～３ｈ，过滤，滤液于４℃、以３２００ｒ／

ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。弃上清，用１．２ｍｏｌ／Ｌ预冷的山梨醇溶液洗原生质体沉淀２