人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范

一、人脐带间充质干细胞的分离和培养

1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;

2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;

3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。

4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;

5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);

6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。

7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。

8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;

9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml

bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;

10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);

11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;

12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;

13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;

614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液

UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。15.细胞融合率到达80%左右时，加胰酶消化，按1: 3传代。

二、细胞传代

1.观察细胞融合率在80%以上时，进行传代;

2.将培养瓶依此排好，取10~20瓶放入超净台，同时举行操纵。

3.依次倒去上清液(预留10~20 ml作终止液)，每瓶插手3 ml心理盐水，洗濯细胞后弃去;

4.每瓶加入2 ml胰酶，消化2~3 min，镜下观察，待细胞收缩变圆，加入1ml终止液终止消化;

5.轻轻拍打培养瓶底面，收集消化液，再用10 ml心理盐水逐瓶洗濯，并收集洗濯液，夹杂消化液和洗濯液，2000 rpm 离心5 min;

66.弃上清液，加入适量脐带无血清培养液重悬细胞，按10/瓶接种，每瓶培养液终体积为10 ml。

三、细胞冻存

1.预先配置细胞冻存液(FBS + 10% DMSO):取50 ml离心管，插手FBS，然后逐滴插手DMSO并摇匀，放入4?C培养箱冷藏。7

2.将消化得到的细胞悬液2000rpm离心 5 min，按10/ml密度重悬于细胞冻存液，分装入冻存管，每管装量不超过1 ml;

3.将冻存管置入预先安排室温下的梯度降温盒后，放入-80?C冰箱。

4.24 h后，将冻存管放入冻存盒内，继续于-80?C 冰箱内储存，或转移至液氮罐中，长期储存;

5.梯度降温盒每使用5次更换一次异丙醇，每次加液量为250 ml。