大连理工大学 生化实验B

2014年生物化学实验B

实验报告

姓名：姓名

学号：201247044

实验时间：2014.11.15

实验分组：第七组

组内成员：组员201247002

组员201247020

组员201247060 任课教师：李晓晖

小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子

质量

组员1，组员2，组员3，组员4

化工与环境生命学部 化工学院 化学工程与工艺（国际）1201班

摘要 本文以从小牛肠中提取碱性磷酸酶为例，介绍了生物体中分离、提取酶的方法，以及如何使用考马斯亮蓝法测定所提取酶的蛋白含量并以此得出酶活。同时通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定给定蛋白质样品的相对分子质量。

关键词 小牛肠碱性磷酸酶 酶活 对硝基苯酚 吸光值 考马斯亮蓝R-250 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量

碱性磷酸酶（AKP,EC 3.1.3.1）是一种非特异性水解酶，广泛存在于动物各脏器、微生物和植物中。它在体外能催化多种磷酸单脂类化合物的水解，得到相应的醇。不同来源的AKP ，其分子量和亚基结构各不相同。

小牛肠碱性磷酸酶相对分子质量为145000，等电点为7.5。在体外可催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，后者在405nm 光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。

酶活定义：在最适条件下，以每分钟催化水解1µmol 底物的酶量为一个酶活力单位。本实验温度取37℃。

酶活力的计算：

酶活力（u/mg ）=L C V D

V A E R ⨯⨯⨯⨯⨯∆405E min /

式中，∆A/min 为405nm 波长下的吸光值的变化率；V R 为反应液的体积，D 为稀释倍数；E 405为405nm 波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数，18.3；V E 为所加酶液体积；C 为蛋白浓度；L 为比色皿光程。

考马斯亮蓝R-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝R-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm ，后者为595nm 。在一定蛋白浓度范围内（0.01-1.0mg/L ），蛋白质-色素结合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、分析蛋白质的常用方法，在科研工作中，经常需要从凝胶中回收蛋白质，用于蛋白质的测序和制备抗体[1]

。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷、大小、性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。但如果加入足够量十二烷基硫酸钠（SDS ）和巯基乙醇，SDS 就可以使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质-SDS 复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于相对分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的

相对分子质量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括浓缩胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的浓缩胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变形和解聚，解离成亚甲基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子质量。

1 实验部分

1.1试剂与仪器

（1）试剂

①正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）。

②1mol/L乙酸（CH3COOH）,1mol/L NaOH，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠，二乙醇胺，盐酸。

③平衡缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.0×10-3mol/L MgCl2和1.0×10-5mol/L ZnCl2。

④底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液(pH9.8)，含1.0×10-3mol/L MgCl2。

⑤酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。

⑥考马斯亮蓝G-250溶液。

⑦ 30%丙烯酰胺。

⑧分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，已加入10% SDS）、浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8)，已加入10% SDS）

⑨ 10%过硫酸铵（AP）、TEMED（四甲基乙二胺）

⑩上样缓冲液（称100mg SDS，2mg溴酚蓝，2g甘油，加0.1mL巯基乙醇，2ml 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10mL）、染色液(配制含0.1%考马斯亮蓝R250，体积分数40%甲醇，体积分数10%冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用)、脱色液（500mL体积分数10%甲醇和体积分数10%冰醋酸的脱色液1000mL）、电泳缓冲液（含0.1% SDS，0.05mol/L Tris，0.384mol/L 甘氨酸pH8.3）。

（2）仪器及耗材

离心管，剪刀，载玻片，冰冻离心机，滤布，量筒，烧杯，移液枪，试管，制胶板，染色缸，所需仪器见下表。

1.2 实验过程

（一）小牛肠碱性磷酸酶的提取与酶活测定

(1) 酶的分离

①取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片将肠黏膜刮下，加入匀浆机中高速匀浆15s，

重复二十次。

②用量筒量体积后放入烧杯中，加入1.5体积的蒸馏水，摇匀。

③缓缓加入1倍体积的冰冷正丁醇，摇匀，将匀浆倒入离心管中，配平，4℃、10000r/min 离心15min。

④取下层水相，用滤布过滤除杂质，把清液倒入分液漏斗静置取下层清液，然后用1mol/L HAc调pH到4.9，4℃下10000r/min离心10min。

⑤取上清（12.9mL），用1mol/L NaOH调pH至6.5，加入5%的硫酸铵0.6455g，摇匀至溶解后，再加入0.47倍体积（6.1mL）的冰冷丙酮，混匀，4℃放置41min。

⑥4℃、10000r/min离心10min，除去沉淀，向上清液（18.5mL）中加入1.07倍体积（19.8mL）的冰冷丙酮，4℃放置31min。

⑦ 4℃、10000r/min离心10min，保留沉淀，逐渐加入平衡缓冲液，使沉淀刚好完全溶。

（2）酶活力的测定

①取150µL酶的底物溶液，置于37℃水浴中10min；

②用平衡缓冲溶液将酶液稀释10倍（10µL酶溶液稀释至100µL）；

③取两个2mL（0.5光程）比色皿，各加入1.5mL底物缓冲液，放入分光光度计中校对归零；

④取出其中一个加入20µL稀释后的酶液，迅速摇匀，放回分光光度计中，测定酶动力学曲

线，读出吸光值的变化率。

（二）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

①玻璃试管中加入5ml考马斯亮蓝。

②在1.5ml离心管中，取实验一（1）中的酶液10µL分别稀释25、50、100倍。

③各取100µl加入到5ml考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5min以上（观察溶液至浅蓝色）。

④紫外分光光度计检测条件：595nm波长；

⑤取2个比色皿（1cm光程），加入考马斯亮蓝（比色皿的2/3），分光光度计中校对归零。将样品放入外侧比色皿中，读取吸光值（0.1-0.5之间）。根据蛋白质浓度标准曲线计算蛋白质浓度。

（三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量

（1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。

（2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。

分离胶配制

最后加入TEMED,应快速摇匀分离胶，向玻璃板间隙，沿着长玻璃板的内侧缓缓注胶，然后再用移液枪贴壁慢慢移动注入乙醇200µL，以防止氧气进入胶内。15min后，分离胶和乙醇之间出现分界线，表明分离胶凝固，倒出乙醇。

（3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。

浓缩胶配制