膜片钳

㈢分析
1.事件检测方法——50％阈值检测法： 将阈值水平设在开放水平与关闭水平中间
2.单通道电流幅度和电导的分析 ➢目的：揭示通道的通透性机制；帮助区分通道的类 型、通道不同的亚单位组成以及突变等 ➢单通道电流的分析—— 幅度直方图 ➢单通道电导的计算 ⑴斜率电导：步阶电压（voltage step）；斜坡电压 （voltage ramp） ⑵拟合电流幅度直方图：高斯拟合
Rs的影响：使膜电位对命令电压的反应时间延迟；产生 电压降，影响钳制电位的数值；与膜电容形成一个单极 RC滤波器，限制了摄取电流信号的频带宽。
膜电阻（Rm）：指电流通过细胞膜时所遇到的阻力。 在静息状态下，Rm主要来自脂质双分子层的电阻。
3. 膜漏电流去除：
➢电容器（capacitor）：
被绝缘体隔开的两个导体 的组合，其储存电荷的能 力用电容（capacitance） 表示。
㈡ Ag/AgCl电极
Ag + Cl-
电子从Ag/AgCl 电极流向浴液
AgCl +e电子从浴液流向Ag/AgCl电极
➢长时间导通电流，AgCl会消耗掉，要定期镀AgCl： 含Cl-的溶液，长度为1～1.5cm
➢玻璃微电极尾端烧灼，防止AgCl被刮掉
电极电阻
二、封接
测试脉冲（20mV） 产生的电极电流
原因：离子通道的开放导致膜电阻迅速降低，电流 和电压的关系偏离了欧姆定律。
分外向整流和内向整流
外向整流：指随膜电位的去极化，I-V曲线靠近y轴
内向整流：指随膜电位的去极化，I-V曲线靠近x轴
（2）离子通道的激活（activation） （3）离子通道的失活（inactivation） 衰减（decay）：通道在激活因素持续存在条件下的 失活。用衰减的时间常数来表示 稳态失活（steady-state inactivaion）：反映通道 失活数目的电压依赖性，可用失活曲线表示 （4）通道失活后的恢复 通道失活后，必须将激活因素去除并维持一定时间， 才能使通道脱离失活状态，再次给予激活因素时通道 才能恢复开放。维持时间即通道失活后的恢复时间。 （5）离子通道的去激活（deactivation） 指在激活因素结束时通道的关闭过程，所记录到的电 流称尾电流。有些离子通道的尾电流也具有电压依赖 性，关闭过程呈指数分布。
3.单通道开关动 力学分析
方法：做通道开 关时间的事件频 数直方图；选择 合适的指数方程 进行拟合；求开 关时间分布的时 间常数τ值。
α 关闭 开放
β
速率常数： α＝1/τo β＝1/τc
T1=0.07ms T2=10.16ms T3=29.97ms
T1=0.02ms T2=9.02ms T3=50.00ms
时间常数：指从最大值变化到原来的37％或从0变化到 最大值的63％所需的时间。
二步法：垂直拉制器 三～五步法：水平拉制器 入水电阻：单通道6～10M欧
全细胞2～5M欧
3. 涂胶：降低噪声 ➢硅酮树脂Sylgard＃184 ➢原则：离尖端越近越好，涂满整个颈部、肩部 4. 抛光 目的：使尖端光滑，利于封接；防止刺入细胞；烧 去涂胶时残余的树脂 5. 充灌 尖端：虹吸，时间尽量长 尾端：1cm左右高度 弹去气泡
自发突触开放 事件：
amplitude(pA)
gapfree
10
0
Minianalysis
-10
软件分析
-20
-30
-40
con dAPV con-dAPV
快电容与慢电容： 快电容：指分布电容，主要为电极电容（Cp）。与放 大器输入相连。瞬间被充电，封接后补偿快电容 慢电容：指电极尖端与地（或浴液）之间的电容。与 串联电阻相连。需经电极电阻充电。破膜后补偿慢电 容
去极化电流——微电极尖端流向细胞内的正电流 超极化电流——微电极尖端流向细胞内的负电流
膜片钳记录的大致过程
一、电极 ㈠ 玻璃微电极
1. 基本特性 ➢ 是噪声的主要来源 ➢几何形状：杆部，肩部，颈部（短，半径大），尖 部（决定Rp，1～3微米） ➢玻璃的选择：硬质硼硅酸盐玻璃
2. 玻璃微电极的拉制 ➢玻璃毛坯外径1.3-1.7mm，内径1.0-1.2mm，壁厚 0.2mm以上 ➢清洗：超声波法（无水乙醇+超声10min），重酪酸 法（24h） ➢拉制：不能碰铂金片
封接电阻
1. 电极安装 2. 电极入水（正压）：
可检测系统密闭情况 3. 封接：（Rp变化0.1-
0.3）撤正压，施负压 单通道：>5G 全细胞：>1G
⑴.封接前补偿液接电位（liquid juntion potential， LJP），用放大器的pipette offset.
LJP:微电极内液与浴液之间、电极内液与细胞内液之间 产生的接触电位。
三、单通道记录
㈠记录模式 ㈡基本概念 o
1.基线（确定） c 2.事件（event） 通道开放与关闭 之间的矩形波 3.单通道电导 G＝i/△V 恒定 4.亚开放状态（substate） 电流幅度比单通道电流幅度小的开放事件 原因：所记录膜片含几种通道；通道不止一个开放状态
5.闪烁现象（flicking） 由于通道的高速开放、关闭导致通道开放或关闭的持 续时间太短，记录到的关闭、开放时间不完全。 包括：高速短时开放和开放时高速短时关闭。 6.爆发式（burst）开放与簇状开放（cluster） burst：密集而短暂的开放事件 cluster：一系列的burst开放 7.驻留时间（dwell time） 反映单通道门控机制的动力学过程，但常用平均开放 或关闭时间 8.组距（bin）：人为设置的一个组的宽度
外式 注，外部物质浓度可变
微管内需低钙以防囊泡形成
全细胞 可改变内部介质以分离电流 内部介质需交换，直径大于
式
外部物质浓度可变
30～40 μm的细胞难钳制
新应用范围：与其他技术的结合
1. 通过检测膜电容的变化分析单个分泌囊泡与细胞膜 融合过程。 2. 检测单细胞中mRNA分子的单细胞PCR技术 3. 全细胞技术与成像技术的结合 4. 检测细胞或膜片分子结构的原子力显微镜技术 5. 研究机械敏感性离子通道的压力钳技术
具体做法：在刺激脉冲施加前或后，软件向细胞施加N个漏减 脉冲诱发漏电流，将漏减脉冲电流的总和与刺激脉冲电流相减。
㈡分析
1.电压门控离子通道 （1）离子通道的I-V曲线 反映通道的激活过程、阈电位、反转电位、整流特性
整流（rectification）：通道电流和电压的关系不满 足欧姆定律的直线关系。
膜电容：脂质双分子层
➢漏电流：
当细胞膜内外电位差发生改变时，膜电阻和膜电容有电 流通过，产生电阻电流和电容电流，两者合称膜漏电流。
膜漏电流去除： ➢电容电流可通过膜电容补偿 ➢电阻电流的补偿：
放大器的漏减功能（leak subtracition） ； Clampex软件中的P/N漏减功能：
P指刺激脉冲，用于诱发离子通道电流；N指漏减脉冲的个 数，漏减脉冲用于诱发膜漏电流。
接触电位指导电体相接触的界面产生的微小电位差。
⑵.电极电容（Cp）补偿： Cp：包括电极浸液部分的电极内液与浴液之间的跨 壁电容、电极非浸液部分与邻近地表的漂浮电容。 影响： ➢电极尖端的电压变得缓慢 ➢不能区分电极电容与膜电容，膜电容被过高估计 ➢参与形成噪声
补偿： ➢加厚电极管壁：加厚玻璃毛坯；涂硅胶树脂 ➢减小电极浸液深度 ➢放大器补偿：fast钮，slow钮
4.通道开放概率的计算 ➢一个通道：Po=to/T ➢多个通道，且通道总数N已知：Po=To/NT To为通道开放的总时间，等于各个通道水平开放时间和 ➢多个通道，且通道总数N未知： 开放概率用NPo表示：NPo＝To/T
四、全细胞记录
㈠全细胞模式的形成
1. 破膜：快速给负压；电击（Zap） 2. 串联电阻和膜电容补偿
四种记录模式的比较
分型
优点
缺点
细胞贴 不需灌注，不干扰胞浆，调 不能改变细胞内介质，需用 附式 制系统完整 ；确定第二信使 另一电极测量膜电位
的作用
内面向 膜两则均可接近，细胞内离 实验中膜外介质不能改变， 外式 子或调节物质的浓度可变， 需低Ca2+液灌流防囊泡形成
可向膜内表面加酶
外面向 膜两则均可接近，不需浴灌 实验中膜内介质不能改变，
2.配体门控离子通道
（1）浓度依赖性
根据不同配体浓度所产生的全细胞电流幅度的大小， 可作出量效曲线（dose-effect curve）。
（2）电压依赖性
（3）失敏 （desensitization） 受体长时间暴露在 配体或外源性激动 剂的情况下，受体 离子通道会发生自 发性关闭。 衰减过程可反映失敏 （4）使用依赖性（use-dependence） 指作用于受体离子通道内部的拮抗剂随着通道开启次 数的增加，其作用不断增强的性质。
I=V/R I=gV g=I/(Vm-Vrev)
膜片钳技术的分类：
电压钳（voltage clamp） ：向细胞内注入恒定或变 化的电压刺激，记录由此引起的膜电流的变化。
电流钳（current clamp） ：向细胞内注入一定的电 流，抵消离子通道开放时所产生的离子流
膜片钳所需设备：
倒置显微镜、膜片钳放大器、A/D转换器、微操纵器、 电极拉制器、 电脑与 相关软件、 防震台
膜片钳的基本 记录模式
细胞贴附式---内面向外式 全细胞模式---外面向外式
穿孔膜片模式（perforated patch mode）
传统的全细胞膜片钳技术在离子通道电流的记录中 存在机械稳定性差,对细胞的损伤大,以及胞内液的 被渗析影响与细胞内信号转导和离子通道调控有关 的第二信使物质的正常运行.而穿孔全细胞膜片钳技 术应用二性霉素B或制霉菌素在细胞膜上形成特定 的孔道,选择性地允许一些离子和大分子物质,从而 使细胞内环境保持相对稳定,在一定程度上弥补了上 述缺陷,实验成功率也相应提高。