总大肠菌群检验的实验设计

总大肠菌群检验的实验设计
一、实验目的
1、了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性，学会总大肠菌群的检验方法。

2、通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。

3、掌握根据国标设计实验的方法。

二、实验原理
人的肠道中主要存在3大类细菌：大肠菌群；肠球菌；产气夹馍杆菌。

由于大肠菌群的数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，故被定为检验肠道致病菌的指示菌。

我国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中微生物指标由2项增至6项，增加了大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群等指标。

修订了总大肠菌群的指标：饮用水中总大肠菌群【MPN/(100mL)或CFU/（100mL）】不得检出；大肠埃希氏菌【MPN/(100mL)或CFU/（100mL）】不得检出；耐热大肠菌群【MPN/(100mL)或CFU/（100mL）】不得检出，菌落总数(CFU/mL)的限值为100（见附表）。

总大肠菌群的检测方法主要有多管发酵和滤膜法。

前者被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种到乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后，在检索表中查出大肠菌群的近似值。

后者是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但只局限于饮用水或较洁净的水。

本实验采取多管发酵法。

三、实验器材
1、器皿：显微镜、锥形瓶（500ml）、发酵试管(18×180mm)10支、发酵锥形瓶（100ml）2只、移液管10ml一支、量筒（100ml）一支、培养皿（Φ90mm）10套、接种环、试管架。

2、试剂、材料：革兰氏染色液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基、乳糖蛋白胨培养基。

四、实验步骤
1、采样：用事先灭好菌的500mL锥形瓶取宿舍饮用水400mL，先让出水口流一
杯水，再在出水口抹涂一些酒精，避免空气中的杂菌感染，取好后用双层牛皮纸封口。

2、初发酵实验：3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液，接种水样总量为300ml(100ml2份，10ml10份，12支发酵管)水样与培养基比例均为2：1，37℃培养24h~48h 。

若培养基紫色没变为黄色，即不产酸；小倒管没有气体，即不产气，为阴性反应，表明无大肠杆菌存在。

若培养基由紫色变为黄色，小倒管有气体产生，即产酸又产气，为阳性反应，表明有大肠杆群存在。

若培养基由紫色变为黄色说明产酸但不产气，仍为阳性反应，表明有大肠杆群存在。

若小倒管有气体，培养基紫色不变，也不浑浊，是操作技术上有问题，应重做检验。

4、确定性实验
将培养基呈黄色的试管取出，以无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于伊红美蓝培养基平板上划线分离，共四个平板。

置于37℃恒温箱内培养18~24h ，观察菌落特征。

深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑（绿）色，湿润光亮，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落；紫红色的菌落
将具有如上特征的菌落作革兰氏染色镜检，结果为革兰氏阴性的无芽孢杆菌，则表明有大肠杆群存在。

5、复发酵试验
用接种环挑取具有上述特征的菌落于装有10ml 普通浓度的发酵培养基内，每管可挑取同一平板上的1~3个典型菌落的细菌，于37℃恒温箱内培养24h ，有产酸产气者证实有大肠杆群存在，该发酵管被判为阳性管。

根据阳性管数及实验所用的水样量，即可运用如下公式计算： MPN=ml
c ml b ⨯⨯a 1000 a:阳性管数，b ：阳性管数水样体积，c:全部水样体积
或直接查大肠菌群检索表。

五、培养基配方与配制
（1）乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、质量浓度为16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液1mL、(胆盐3g/L)、蒸馏水1000、pH为7.2~7.4。

制备：按配方称取以上材料溶解于1000mL蒸馏水，调整pH为7.2~7.4。

加入质量浓度为16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀后分装于试管内，每管10mL，另取一小倒管倒放于试管内。

塞好棉塞、包装后灭菌，115℃灭菌20min，取出后置于阴凉处备用。

（2）伊红美蓝培养基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、蒸馏水1000mL、质量浓度为20g/L的伊红水溶液20mL及质量浓度为5g/L的亚甲蓝水溶液13mL。

制备：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中调整pH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，灭菌后待用。

使用前加热融化培养基，待冷却至50℃~55℃时，加入伊红和亚甲蓝水溶液，混匀后到平板。

附表《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）。