病理切片技术-学术报告

待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂 直插入水中轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于 玻片上，随即将玻片直立提起，趁玻片上仍有少 量水份时用毛笔，拨正切片位置。如组织较小， 可在玻片上多贴几片或几排，但排列应密集、整 齐。 用铅笔在玻片一端的毛玻璃上写上标本编号 将附贴好的切片置于恒温箱内干燥（温度一般高 于石蜡熔点2-4 ℃ ）
病理切片技术-学术报告
目录
一、取材 二、固定 三、脱水 四、透明 五、浸蜡 六、包埋 七、切片 八、染色
一、取材
取材是制作切片程序中的首要步骤，取材不当， 将直接影响病理诊断和科研工作的效果。组织标 本的选用非常重要，不能随意的切取组织来制作 组织切片，否则病理检验的结果是不会令人满意 的。
二、固定
在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是 大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有 效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的 一系列的制作，直至切片的最后完成。
1.固定的作用
固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是： 保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保 持细胞、组织的固有形态和结构。 从免疫组化技术的角度，使细胞内蛋白质凝固， 尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防 止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；保 持组织的固有形态和结构；保持组织或细胞的抗 原性。
七、切片
一般的切片厚度要求在4—6微米。石蜡切片不但 可以达到这个要求，甚至可以切得更薄到2微米 以至1微米。 还便于制作大批的或是连续的切片。 以石蜡包埋的组织块便于长期保存。 所以石蜡切片是目前各种切片制作方法中最普通 常用的一种方法。
1.切片前的准备
恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。 蜡块整修，将蜡块组织面的石蜡用刀修去，使组 织全部暴露出切面并修平，以减少切片刀的磨损。 载玻片应事先洗涤干净，无油腻和不透明现象。 将锋利的刀片装入切片刀夹钳内，调整角度和位 置后随即紧固。 备用小型毛笔、小型无钩镊子、铅笔。
4.固定液的使用
根据Bencroft的分类法，可分为四种类型： 醛类：甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二 醛，丙二醛等。 氧化剂类：四氧化锇，高锰酸钾，重铬酸钾等。 蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等。 其他：氯化汞，苦味酸等。上述四种类型的固定 剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技 术方面中用到。
透明剂 二甲苯：能与酒精，丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。
对组织的收缩性强，作用迅速，组织在二 甲苯中时间不宜过长 。(常用) 氯 仿：作用缓和 ，不易呈现透明现象 香柏油：处理细柔组织的最佳透明剂 。
五、浸蜡
组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内 浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这 一程序就叫浸蜡。 石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关 。 为了增加石蜡的韧性，可在石蜡中加入一些混合 剂，常用蜂蜡，硬脂酸，松香等。
为加快脱水进程可将标本放入各级酒精内借助机 器或手工震摇，还可以加温促进脱水。即将标本 装在塞紧的玻璃瓶置于包埋箱或温箱内，因液体 受热产生的正压可增加溶液的对流。但热酒精会 使组织过硬，并有爆裂危险，除急诊外，最好不 用此方法。
四、透明
目的是使石蜡渗透到组织中去，达到包埋的支持 作用。 将组织投入可以同酒精又能同石蜡相混合的媒剂 中，组织中的酒精就被该媒剂取代，待酒精完全 被该媒剂完全取代后，组织即成透明状态 透明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡
4-10分钟 片刻 3-5秒钟 片刻-数小时 1分钟 15分钟 1-2分钟
95％乙醇1 95％乙醇2 100％乙醇1 100％乙醇2 二甲苯1 二甲苯2 树胶封片
1-2分钟 1-2分钟 1-2分钟 1-2分钟 1-2分钟 1-2分钟
常规苏木素-伊红染色HE
染液配制 1.Harris苏木素染液配制 2.0.5%伊红酒精染液配制 0.5克伊红溶于100毫升80%酒精中 3.1%盐酸酒精配制 1毫升盐酸溶于99毫升70%酒精中
冲洗 组织经过固定后，脱水之前应进行冲洗，将组织 内的固定液洗干净，否则残留组织内的固定液有 碍制片和染色，而有些固定液则可在组织中继续 起到脆化组织的作用，以至于损坏组织，给制片 工作带来不利。在冲洗时，冲洗剂的选择应依固 定液的种类和性质而有所不同。
冲洗时应注意以下事项： 水溶性的固定剂：需用流水冲洗。 酒精溶剂的固定剂：应用同浓度的酒精浸洗。 含苦味酸的固定剂：（苦味酸与甲醛混合液除 外），须用70％酒精浸洗。 含有升汞固定剂：水或酒精中加碘以洗去组织内 汞的沉淀。 含有铬酸的固定剂：冲洗时置于暗处，以免产生 沉淀或使组织硬化而影响制片。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下 放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。 4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿 使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明 蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常 形成结晶。 5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固， 立即修切，准备制成切片或储藏备用。
3.注意事项
切片质量的好坏，除与技术熟练程度和切片机的 好坏有关外，切片刀是决定的因素 切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生 震动 在摇动切片机时，用力要求均匀一致 在夏秋季节进行切片时，应使用冰块加强冷却
4.贴片
将单张或数张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提 起，铺于恒温水中，（光亮的一面朝下）立即用 毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。如有皱褶时 用镊子细心地逐个轻轻拨开，注意不可拨破组织。 然后分开每张切片，选取其中最完整的，没有皱 褶的切片。
弹性、胶原纤维的双重组合染色法
染液配制 1.维多利亚蓝染色液的配制 2.丽春红S染色液
0.5%丽春红15毫升加苦味酸饱和水溶液85毫升
将维多利亚蓝2克，糊精0.5克，间苯二酚4克， 蒸馏水200毫升混合加热煮沸，约5分钟后，加 入煮沸的30%三氯化铁溶液25毫升，加热搅拌呈 胶体状，去火冷却，将滤渣连同滤纸一起在60℃ 恒温箱烤干，残渣呈深蓝色颗粒状粉末，将其溶 于400毫升70%酒精中，加盐酸4毫升和5克苯酚， 放置一周后成熟。
2.切片的步骤
将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离 开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与 切片刀口要垂直平行。 再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架， 固定好机头。 根据需要调整切片厚度。
摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整 的最大组织切面后，再进行切制。 实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托 起蜡片，协调地进行切片操作。 切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能 将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上 挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒温水面上。
三、脱水
脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下 一步透明及浸蜡创造条件。此外，脱水还可以使 组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在 任何比例下均能混合的液体。
1.常用的脱水剂
酒精 （常用） 丙酮(Acetone) 正丁醇(γ-Buty alcohol) 二氧乙环(Dioxan)
2.组织的摇震
2.石蜡包埋流程
组织取材，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数 小时。 组织流水冲洗6－12小时。 70％酒精2－4小时。 85％酒精2－4小时。 95％酒精（Ⅰ）2－4小时。（可过夜） 95％酒精（Ⅱ）2－4小时。（可过夜）
100％酒精（Ⅰ）2－4小时。 100％酒精（Ⅱ）2小时。 二甲苯（Ⅰ）0.5－1小时。 二甲苯（Ⅱ）0.5小时。 浸蜡（Ⅰ）2小时。 浸蜡（Ⅱ）2小时。 组织包埋。（上述只供参考）
染色方法 组织切片脱蜡（同常规苏木素-伊红染色HE） 切片入70%酒精冲洗2分钟 切片入维多利亚蓝溶液30分钟 95%酒精分色1-2分钟 水洗2分钟 丽春红染色2分钟 无水酒精冲洗2次 稍干燥后，二甲苯透明，中性树胶封片
结果显示 弹性纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，肌肉等背景 色呈淡黄色。
胶原纤维呈红色，平滑肌呈黄色。10X 血管弹力纤维呈紫色。20X
六、包埋
包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡 的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的 包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体 并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后， 进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
1.石蜡包埋法
包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。 手工包埋法： 1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石 蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃 酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。 2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加 温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加 温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊 子注入包埋框内。
1克苏木素溶于10毫升无水酒精中；另将20克钾 明矾加热溶于200毫升蒸馏水。二者混合煮沸， 玻棒搅拌加0.5克氧化汞，流水冷却，隔夜过滤。
脱蜡 二甲苯1 二甲苯2 95％乙醇 95％乙醇 自来水洗
2分钟 2分钟 1分钟 1分钟 片刻
染色：
苏木素浸染
4-10分钟
自来水洗
片刻
1％盐酸乙醇分化 3-5秒钟
2.固定的目的
能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。 保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组 织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活 时的物质一样。 使组织硬化，便于切块。 对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。 保存好大体标本。 可增强染色的作用。
3.固定的注意事项
组织固定越新鲜越好 组织固定，组织块不宜过大 对不同类型的组织应适当合理地选择固定液 组织固定，时间不宜太短，也不宜太长 固定液的量要充分 特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液 组织的第二次固定或后固定
自来水冲洗
片刻-数小时
饱和碳酸锂溶液 1分钟
自来水冲洗
15分钟
0.5％伊红酒精浸染 1-2分钟
脱水，透明，封固
95％乙醇1
1-2分钟
95％乙醇2
1-2分钟
100％乙醇1 1-2分钟
100％乙醇2 1-2分钟
二甲苯1
1-2分钟
二甲苯2
1-2分钟
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树胶封片。
结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红 色，其它成分呈深浅不同红色。
八、染色
染色就是利用染料在组织切片上给与颜色，使其 与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明 后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显 现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细 胞的各种成分。染色剂与组织细胞相结合而使组 织细胞着色的过程与物理和化学作用两者都有关 系。
1.染色过程
苏木素浸染 自来水洗 1％盐酸乙醇分化 自来水冲洗 饱和碳酸锂溶液 自来水冲洗 0.5％伊红酒精浸染