水中大肠杆菌测定教案(精)
水中大肠杆菌细菌总数的检测——环境微生物学实验七
MPN:maximum probable number） MPN计数又称稀释培养计数，适用于测定在一 个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有 特殊生理功能的类群。 水中以100mL水样中大肠杆菌最近似数MPN来表 示 食品中大肠杆菌群数是以每100g检样大肠杆菌 最近似数MPN来表示。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的 选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通 过该生理功能的表现来判断该类群微生物的 存在和丰度。 缺点：只适于进行特殊生理类群的测定，结 果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平 板计数时才采用。 其可靠性是基于检测对象在取样总体中符合 泊松分布。
③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每
稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。
2）LST发酵 接种1mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接 种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土 1)℃温箱内培养（48士2) h。
如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为
大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序
六 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN检索表，
报告每100mL样品大肠菌群的MPN。
结果表示方法：NMPN/100mL
附表：大肠杆菌计数最大可能数（MPN）检索表
注：
①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和
0.01 mL (g)。每稀释度3管。
②表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和
根据以上所获得的数据 报告表示为：N cfu/100mL cfu(Colony-Forming Units)
5.3实验所需培养基及作用
LST肉汤培养基（初发酵）
EC肉汤培养基（复发酵）
伊红美蓝琼脂培养基（ 分离培养）
5.水中大肠杆菌的检测（多管发酵法）
5.水中大肠杆菌的检测（多管发酵法）第一篇：5.水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)水中大肠杆菌群书的监测（发酵法）一、试验目的：1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。
2.学习和掌握水中大肠杆菌的监测方法。
二、试验原理：水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。
多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅用于自来水和深井水。
操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。
三、试验材料：1.培养基：乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基2.器材：灭菌三角瓶、无菌平皿、无菌吸管、无菌试管等。
四、试验内容第一天：1.水样的采集自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。
2.用发酵法检查大肠杆菌（1）生活饮用水的检验①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。
摇匀后，37℃培养24ｈ第二天：②平板分离：经24ｈ培养后。
特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。
大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
第三天：③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
第四天：④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查附录1或2，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）五、思考题记录试验结果，并对所测样品作出评价。
实验八 水中大肠杆菌的测定
（三）多管发酵法检测大肠菌群
1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每支分别 加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵 管，每支分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养 基的初发酵管，每支分别加入按1：10稀释的水样1mL，均 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
三、实验材料和用具
1、培养基 复红亚硫酸钠培养基、乳 糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨 培养液、3倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊 红美兰培养基。
2、仪器及用具 微孔滤膜（0.45um）、 滤器（500mL）、抽气设备、镊子、 发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻 度吸管或移液管、接种环、酒精灯。
四、操作步骤
（一）水样的采集
1.自来水 将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌， 在拧开水龙头流水5min，以排除管道内积存的死 水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样。
2.池水、河水、或湖水 将无菌的带玻璃塞的小口 瓶侵入距水面10~15cm深的水层中，瓶口朝上， 除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取 出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超 过24h。
（二）滤膜法检测大肠菌群
1.无菌滤膜 无菌镊子 滤器膜承受器，过滤杯——滤膜承 受器，旋紧。真空泵——抽气口
2.水100mL滤杯，启动抽真空系统，使水从下端流出。 3.有细胞的滤膜 无菌镊子 平贴于复红亚硫酸钠固体培养
基上（紧贴，无气泡），37℃培养16~18h。挑选红色或紫 红色、带有或不带有金属光泽的菌落，或淡红色、中心颜 色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。 4.经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，接种到乳糖蛋白 胨半固体培养基上， 37℃培养6~8h后观察，产气者为阳 性（观察要及时，以免气泡消失） 5.结果计算
微生物综合实验水中细菌总数和大肠菌群的测定(精)
微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。
四、实验步骤第一周（2008-11-11）1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
2、配制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3、将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。
水中大肠杆菌测定教案
教案教师姓名王承莉讲课班级0911 食品讲课地址系实训室讲课日期2011 年5 月 29 日第 14 周讲课时数 2讲课内容学习情境 6 微生物检测任务二：水中大肠杆菌的测定1、学生依据任务通知单采集信息2、学生领取工作任务并梳理和学习有关知识（1）中国安全饮用水国家标准 GB5479-2006 ；细菌培育的条件（2）大肠杆菌的特征：能发酵乳糖产酸产气教课方案（ 3）培育基的配制、灭菌技术；（ 4）细菌培育和分别纯化的操作过程；革兰氏染色判定等3、依据任务单初步写出检测方案4、学生疏组议论、教师指导总结，最后确立检测方法5、学生依据检测方案对水样进行检测，填写查验报告6、教师对学生任务达成状况进行总结剖析知识1、掌握安全饮用水标准、大肠杆菌特征及检测方法及培育细菌的条件教课目的目标2、学会使用 MPN检索表能力1、掌握培育基配制技术目标2、掌握过微生物发酵培育技术3、掌握分别纯化技术教课要点、要点：发酵试验、分别培育难点难点：复发酵考证能力训练1、发酵培育任务2、分别纯化课外作业 1.大肠菌群的定义是什么？有何特色？2.大肠菌群以为是被肠道病原菌污染的指示菌，为何？3.乳糖胆盐培育基是哪一种类的培育基？课后领会审阅评语审阅人讲课主要内容及板书设计第一步：依据任务通知单指引学生采集信息，进行课程导入水质安全事故频发，水质查验势在必行。
大肠菌群是评论水质利害的一个重要的卫生指标，也是反应水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
第二步：依据工作任务，采集有关信息，获取有关知识一、大肠杆菌的特征大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h 发酵乳糖并产酸才产气。
二、食品中大肠菌群的含义和有关标准食品中大肠菌群数是以每100mL （ g）检样内大肠菌群近来似数（简称MPN ）表示。
据此含义，全部食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL（ g）食品内同意含有大肠菌群的实质数值为报告标准。
实验九 水中总大肠菌群的测定课件
用漏斗分装培养基及摆斜面
培养基的分装： 一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3 ~4毫升(1/4~1/3试管高度)，如制作深层培养基，每只20×220毫米 的试管约装12~15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一 半为宜。
令包扎
1．培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2．吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉 花要塞得松紧恰当(过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会 下滑)，然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与 报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。 3 ．三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端， 与报纸约呈45º角，并将右端多余的报纸打一小结。 4. 玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160－170℃灭菌2h.
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
五 操作步骤 1 水样的采取
(1)检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，
在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。
(2)检测池水、河水或湖水 应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下
每组：
三倍浓缩乳糖蛋白胨(5ml) 15管 普通浓度乳糖蛋白胨(10ml) 15管 伊红美兰培养基 150ml (5个平板) 三角瓶1个(装27mL蒸馏水灭菌)、 10ml吸管 2支、 1ml吸管2支包扎灭菌
表2 最可能数(MPN)表
(接种5份10mL
水样、 5份1mL水 样、 5份0.1mL水 样时，不同阳性 及阴 性情况下 100mL水样中细 菌数的最可能数 和95%可信限值)
实验九 水中总大肠菌群的测定
实验 水中细菌总数的测定 水中大肠杆菌的测定
实验2 水中大肠菌群数的测定一、目的要求1．了解大肠菌群数量在引用水中的重要性2．学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数二、原理若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。
若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。
最广泛应用的指示菌是大肠菌群，它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37ºC、24～48h培养能产酸产气，根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。
多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。
三、实验仪器和材料1．锥形瓶（500 ml）、试管（18 mm×180 mm）、大试管（容积150 ml）、移液管1 ml 及10ml、培养皿（直径90 mm）、接种环、试管架1个。
2．革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液3．显微镜4．自来水（或受粪便污染的河、湖水）400ml5．蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液、5％碱性品红乙醇溶液、2％伊红水溶液、0.5％美蓝水溶液。
6．10％NaOH、10％HCl、精密pH试纸6.4～8.4。
水中大肠杆菌的检测实验报告
1. 掌握水中大肠杆菌检测的基本原理和方法。
2. 了解水中大肠杆菌污染的严重性及预防措施。
3. 培养实验操作技能，提高对水质监测的认识。
二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是一种条件致病菌，广泛存在于人和动物的肠道中。
在水质监测中，大肠杆菌常作为粪便污染的指示菌。
本实验采用伊红美蓝培养基进行大肠杆菌的检测，通过观察菌落特征，确定水中大肠杆菌的存在。
三、实验材料1. 实验器材：无菌试管、移液器、培养箱、酒精灯、无菌棉签、试管架、培养皿、显微镜等。
2. 实验试剂：伊红美蓝培养基、无菌水、水样、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。
四、实验步骤1. 水样采集：采集待检测水样，用无菌容器盛装，避免污染。
2. 水样稀释：将水样进行适当的稀释，以便在培养基上形成单菌落。
3. 接种：取适量稀释后的水样，用无菌棉签均匀涂布于伊红美蓝培养基表面。
4. 培养：将接种后的培养基放入培养箱中，在37℃条件下培养24小时。
5. 观察：观察培养基上的菌落特征，如菌落大小、形状、颜色等，判断是否存在大肠杆菌。
6. 鉴定：对疑似大肠杆菌的菌落进行进一步的鉴定，如革兰氏染色、生化试验等。
五、实验结果与分析1. 菌落观察：在伊红美蓝培养基上，大肠杆菌菌落呈深紫色（黑色），边缘整齐，有金属光泽。
2. 鉴定结果：经革兰氏染色和生化试验，证实所观察到的菌落为大肠杆菌。
1. 大肠杆菌是水质监测中的重要指标，其存在表明水质可能受到粪便污染，存在健康风险。
2. 本实验采用伊红美蓝培养基进行大肠杆菌检测，操作简便，结果准确。
3. 在实际水质监测中，还需结合其他指标，如粪大肠菌群、耐热大肠菌群等，全面评估水质状况。
七、实验总结1. 本实验成功检测了水中大肠杆菌，掌握了水中大肠杆菌检测的基本原理和方法。
2. 通过实验，提高了对水质监测的认识，增强了环保意识。
3. 在今后的学习和工作中，将继续关注水质问题，为保护水资源、保障人民群众健康贡献力量。
测大肠杆菌群
多管发酵法测大肠杆菌群一、实验目的1、学习测定水中大肠杆菌群数量的国标测试法（主要为多管发酵法）2、了解大肠杆菌群的数量在水中的重要性二、实验原理我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准具体规定如下：1、细菌总数1ml水中不超过100个。
2、大肠杆菌数1L水中不超过3个。
3、若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过10000个。
多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN 来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法1、初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经37 ºC培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判断是否有大肠菌群存在。
2、平皿分离（证实试验）（1）水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。
（2）将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。
3、复发酵试验(完成实验）（1）将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 ºC培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。
KJ08微生物学实验-水中大肠菌群的简易检测(精)
实验原理
水中细菌总数可以说明水被有机物污染的程度，细菌数 越多，有机物质含量越大。水中细菌种类繁多，生长条 件各异。在一种培养条件下满足所有细菌生长是不可能 的。通常采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，测得水中细菌 总数的近似值。 水中病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌等）多数源于病人 和病畜的粪便，病原菌数量少且检测过程复杂。大肠菌 群作为肠道内的正常菌，在粪便中数量大，且体外的存 活时间与肠道致病菌相近，因此，一般采用测定大肠菌 群数量来判断水源是否被粪便污染，并推测是否受肠道 病原菌污染的可能。
化学与生 命科学学 院
思考题
• 检测自来水的细菌总数时为什么要
做空白对照试验？如果空白对照上 有少数几个菌落说明什么？很多菌 落又说明什么？
化学与生 命科学学 院
实验八
水中细菌总数的测定及 大肠菌群的简易检测
化学与生 命科学学 院
实验目的
• 了解水质状况与细菌数量的联系。 • 了解水中细菌总数的测定依据及应
•
用，掌握水中细菌总数测定的方法 及操作。 了解饮水健康与水中大肠菌群的联 系，掌握水中大肠验原理
化学与生 命科学学 院
实验原理
我国1985年起实施的饮用水卫生标准（GB574985)规定：1毫升自来水中的细菌总数不得超过100 个，每升自来水中肠道菌群不得超过3个。
化学与生 命科学学 院
实验内容
一、自来水中细菌总数的测定
1、采水样：开放水龙头使水流5min，以无菌三角瓶接取 水样，迅速测定。 2、用无菌吸管分别吸取1ml水样与两个无菌平皿中，分 别倒入融化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即 旋转混匀。 3、另取一无菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基， 作为空白对照。 4、凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h后计数，取两皿 平均数作为1ml水样中的细菌总数。
大肠杆菌的测定(精)
水中总大肠杆菌的测定来源:加入时间:2010-3-30 12:15:511 原理总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖,产酸产气以及具备革兰氏染色阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验,求得水样中的总大肠菌群数,实验结果以最可能数(most probable number,简称 MPN 表示。
2仪器2.1 高压蒸汽灭菌器。
2.2 恒温培养箱,冰箱。
2.3 生物显微镜,载玻片。
2.4 酒精灯,镍铬丝接种棒。
2.5 培养皿 (直径 100mm ,试管(5×150mm,小倒管,吸管 (1, 5, 10ml ,烧杯 (200, 500, 2000ml , 锥形瓶 (500, 1000ml ,采样瓶。
3 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液:将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉浸膏、 3g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶于 1000mL 蒸馏水中,调节 pH 为 7.2-7.4, 再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL ,充分混匀,分装于试管(内有倒管中,于 121℃高压灭菌器中灭菌 15min ,贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液:按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。
除蒸馏水外,各组分用量增加至三倍。
3.3 品红亚硫酸钠培养基3.3.1 贮备培养基的制备于 2000mL 烧杯中,先将 20-30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中,加热溶解,然后加入3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨,混匀,使其溶解,再用蒸馏水补充到 1000mL 调节溶液pH 至 7.2-7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加 10g 乳糖,混匀,定量分装于 250或500mL 锥形瓶内,置于高压灭菌器中,在 121℃灭菌 15min , 贮存与冷暗处备用。
3.3.2 平皿培养基的制备将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按 1:50比例吸取 5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中;再按 1:200比例称取无水亚硫酸钠,置于另一灭菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解,再置于沸水浴中煮沸10min (灭菌。
实验九 水中大肠菌群数的测定
实验九水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。
二、实验材料1.样品：水样2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。
3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。
由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。
如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。
大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。
检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。
取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。
取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口内部。
在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。
如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。
2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。
3.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。
实验6 水中大肠菌群
实验六水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测一、实验目的1.采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群数。
2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。
二、实验原理如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。
由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。
大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。
即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个．大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌，包括四种细菌：大肠埃希氏杆菌、枸椽酸盐杆菌、产气杆菌及副大肠杆菌。
它们有相似的生化反应，能发酵葡萄糖，产酸产气，但发酵乳糖的能力不同。
当将它们接种到含乳糖的远滕氏培养基上生长时，四种菌的反应不一样，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸椽酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落无色透明(因不利用乳糖所致)。
本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，这一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。
本法除了用于检测水样(淡水或海水)外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。
测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50g 样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验。
三、实验材料1.培养基；1.1乳糖胆汁液体培养基：蛋白胨：20.0g， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液：l ml，乳糖：5.0g，胆酸钠：5.0g将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115ºC灭菌20min。
实验八 水中大肠杆菌的测定
三、实验材料和用具
1、培养基 复红亚硫酸钠培养基、乳 糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨 培养液、3倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊 红美兰培养基。 2、仪器及用具 微孔滤膜（0.45um）、 滤器（500mL）、抽气设备、镊子、 发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻 度吸管或移液管、接种环、酒精灯。
四、操作步骤
（三）多管发酵法检测大肠菌群
1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每支分别 1.取 支装有3 加入水样10mL。另取5 加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵 管，每支分别加入水样1mL。再取5 管，每支分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养 基的初发酵管，每支分别加入按1 10稀释的水样1mL，均 基的初发酵管，每支分别加入按1：10稀释的水样1mL，均 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。 2.取出培养后的发酵管，观察发酵液的颜色为黄色者记录为 2.取出培养后的发酵管，观察发酵液的颜色为黄色者记录为 产酸，杜氏小管内有气泡者记录为产气。将产酸产气和产 酸的两类发酵管分别划线接种于伊红美兰培养基上，在 37℃恒温箱中培养18~24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有 37℃恒温箱中培养18~24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有 或不带有金属光泽的菌落、或淡紫红色和中心色较深的距 离，将其一部分分别取样进行涂片和革兰氏染色观察
3.经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，者将它的另一 3.经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，者将它的另一 部分接种于装有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培养 液的复发酵管中，每管接种菌落1~3个， 37℃ 液的复发酵管中，每管接种菌落1~3个， 37℃培 养24h，有产酸产气者为大肠菌群，记为阳性管。 24h，有产酸产气者为大肠菌群，记为阳性管。 4根据3个梯度（10mL、1mL、0.1mL）的5支中 根据3个梯度（10mL、1mL、0.1mL）的5 出现阳性管数，查表细菌最可能数，再乘以100 出现阳性管数，查表细菌最可能数，再乘以100 换算成1L水样中的大肠菌群数。 换算成1L水样中的大肠菌群数。
如何检测水样中的大肠杆菌
如何检测水样中的大肠杆菌1、配稀释液（0.85%生理盐水——0.85g氯化钠+100ml水）和乳糖胆盐培养液（180ml）；2、取4只试管，每只中加入9ml稀释液并盖上塞子；3、另取4只试管，每只中放入一只小导管后加入10ml乳糖胆盐培养液，再盖上塞子；4、配品红琼脂225ml（加热煮沸至全溶），入45度水浴中；5、配乳糖发酵液180ml；6、平皿用牛皮纸包成筒（15个）、试管用金属篓子装起、移液管用专业长筒装上同上一起灭菌。
7、取出放入冰箱（只是品红琼脂立马倒15个平皿（15ml/个））；8、将2步中的4只试管放在试管架上，用灭菌吸管在第一只管中加1ml样品摇匀；另用一只灭菌吸管从第一管中取1ml加入第二管中摇匀，该吸管用后插入第一管；又用一只灭菌吸管从第二管中取1ml加入第三管中摇匀，该吸管用后插入第二管；再用一只灭菌吸管从第三管中取1ml加入第四管中摇匀。
若样品较脏，据情况可多做几个梯度。
9、初发酵：用1ml灭菌吸管吸各梯度的样1ml，分别接种在1管单料乳糖胆盐发酵管内，置44.5度培养箱中培养24h。
10、观察各管产酸（紫变黄）产气（小导管中）情况，从最右端产酸产气的一管开始往左取连续的四管进行分别涂板。
11、涂板，用接种环（在酒精灯上灭菌）取一环阳性液在平皿边缘开始涂板（约1/4面积），又从垂直方向（上边缘）涂板，只拉三条带菌线，涂成1.5/4面积，再从第二区边缘且垂直其划线方向涂板，只拉两条带菌线（目的是培养出单个的菌落）；12、将涂好的放入37度培养24h后，取一片载玻片，用在酒精灯上灭菌后的接种环取2环生理盐水到玻片两端，再轻取典型菌落和非典型菌落各取一丁点儿在上片生理盐水中涂片（本应无色，若有紫色，是取到了琼脂），然后拿起玻片在火上方烤干，达到杀死菌并固定菌的作用。
13、染色：夏天染1分钟，冬天染2分钟。
A蓝色盖染液滴满玻片上固定的区域染色后开细水冲掉多的染液，用滤纸占去片上的水，B 黃色盖染液滴满片上固定区染色，细水冲，滤纸占，C 黑色盖滴满上区脱色，不计时，水冲占干，D 红色盖染液滴满上区10秒后水冲占干。
水中细菌总数和大肠杆菌检测
（EMB）、牛肉膏蛋白胨培养基
四、实验步骤-细菌总数测定
1.以1ml无菌吸管吸取样品1ml加入9ml 无菌生理盐水， 使样品（自来水、饮用水、饮料等）成 1：10 、1： 100 、1：1000 等几个稀释度；样品（下水道水、牛 奶）稀释度要适当高。 2.分别在无菌平皿内加入1：100、1：10、原样的样品 各1ml，每个稀释度均做一个平板。 注意 ：先加浓度低的样品，再加浓度高的样品 3.将冷却45℃的营养琼脂倾注于平皿中，摇匀，置37 ℃培养24小时。
3
2,890
271 60
2.2 27，100 27，000或2.7×104
4
不可计 4，650 513
— 513，000 510，000或5.1 ×105
5
27 11 5 —
270
270或2.7 ×102
6Leabharlann 不可计 305 12— 30，500 31，000或3.1 ×104
7
不可计 不可计 不可计 —
200
70
890
2
1
2
270
2
1
3
340
2
2
0
210
40
470
2
2
1
280
100
1500
2
2
2
350
2
2
3
420
2
3
0
290
2
3
1
360
2
3
2
440
2
3
3
530
3
0
0
230
40
任务二水中大肠菌群数的测定精
项目九 综合实训---水中总大肠菌群的测定
四、结果报告
• 观察乳糖发酵管产气情况
– 产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在
• 查MPN 检索表
– 根据证实为总大肠菌群阳性的管数
• 报告每100ml水样中的总大肠菌群最可能 数（MPN）
项目九 综合实训---水中总大肠菌群的测定
四、结果报告
• 5管法结果见表1，15管法结果见表2
检验程序
生活饮用水 接种
水源水稀释与 接种
乳糖发 酵试验
分离培 养
证实试 验
结果报 告
项目九 综合实训---水中总大肠菌群的测定
一、乳糖发酵（初发酵）试验
• 自来水
– 直接接种10mL水样于双料培养基，每个水 样共接种5管
• 水源水
– 加大稀释度，每个稀释度接种5管，每个 水样共接种15管
项目九 综合实训---水中总大肠菌群的测定
项目九 综合实训---水中总大肠菌群的测定
习题作业
1.判断食品是否被肠道致病菌所污染及其污染 程度时，常用总大肠菌群作为指示菌来表示， 该指示菌应具备的条件有哪些。 2.总大肠菌群和粪大肠菌群有什么区别？如何 区分粪大肠菌群和非粪大肠菌群。
项目九 综合实训---水中总大肠菌群的测定
习题作业
3.检样从开始稀释到接种所用时间不宜超过 15min，为什么？ 4.单料和双料培养基有什么区别？什么时候使 用双料培养基？ 5.生活饮用水的菌落总数、总大肠菌群标准是 多少？畜禽饮用水总大肠菌群标准是多少？
实验器材
• 其他
– 无菌工作台、酒精灯、稀释液、灭菌吸管、 灭菌试管、小倒管、试管架、接种环、恒 温培养箱、高压蒸汽灭菌器、载玻片、香 柏油、平皿、天平、电炉等
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（4）细菌培养和分离纯化的操作过程；革兰氏染色鉴定等
3、根据任务单初步写出检测方案
4、学生分组讨论、教师指导总结，最终确定检测方法
5、学生根据检测方案对水样进行检测，填写检验报告
6、教师对学生任务完成情况进行总结分析
教学目标
知识
目标
1、掌握安全饮用水标准、大肠杆菌特性及检测方法及培养细菌的条件
二、食品中大肠菌群的含义和相关标准
食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（简称MPN）表示。据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据数量的多少，判定食品受污染的程度。我国生活饮用水卫生标准中规定1L水样中总大肠菌群数不超过3个。
三、大肠杆菌的测定方法（乳糖发酵法）
第三步：学生根据工作任务，分组调研，收集资料并尝试制定检测方案
第四步：通过学生分组讨论、教师指导总结，最终确定检测方法
第五步：根据检测方案对水样进行检测，填写检验报告（检测方案见下图）
第六步：分析工作任务的完成情况，存在问题和原因以及解决方案，总结操作过程中的经验和注意事
教案
教师姓名
王承莉
授课班级
0911食品
授课地点
系实训室
授课日期
2011年5月29日第14周
授课时数
2
授课内容
学习情境6微生物检测
任务二：水中大肠杆菌的测定
教学设计
1、学生根据任务通知单收集信息
2、学生领取工作任务并梳理和学习相关知识
（1）中国安全饮用水国家标准GB5479-2006；细菌培养的条件
（2）大肠杆菌的特性：能发酵乳糖产酸产气
根据工作任务单，利用学习资源，对照资讯问题，熟悉天牛形态、发育特征和发生规律，制定天牛的识别及防治计划并组织实施
第七步：考核评价
任务资讯引导单
学习情境2害虫防治
学时16
子学习情境2.2（1）天牛类害虫的识别与防治
学时2
资讯方式
利用教材、教辅材料、精品课程网站、多媒体教学课件等获得相关的任务资讯
资讯
1、天牛的成、幼口器各属于什么类型？
2、天牛的危害有什么特点？本地区常见的有哪些种类？
3、天牛属于什么变态类型？
4、园林植物天牛类害虫难以防治的原因是什么？
课后体会
审阅
评语
审阅人
授课主要内容及板书设计
第一步：根据任务通知单引导学生收集信息，进行课程导入
水质安全事故频发，水质检验势在必行。大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
第二步：根据工作任务，收集相关信息，获得相关知识
一、大肠杆菌的特性
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h发酵乳糖并产酸才产气。
5、光肩星天牛主要为害哪些园林植物？
6、光肩星天牛、星天牛如何区分？
7、光肩星天牛在江苏地区什么时间为害最重？
8、天牛有哪些习性可用于防治？
9、天牛的天敌有哪些？生产上大面积应用的主要是哪些？
10、天牛的防治适期是？
11、天牛的防治方法有哪些？
12、用于防治天牛的高效、安全药剂有哪些？如何使用？
资引导
2、学会使用MPN检索表
能力
目标
1、掌握培养基配制技术
2、掌握过微生物发酵培养技术
3、掌握分离纯化技术
教学重点、
难点
重点：发酵试验、分离培养
难点：复发酵验证
能力训练
任务
1、发酵培养
2、分离纯化
课外作业
1.大肠菌群的定义是什么？有何特点？
2.大肠菌群认为是被肠道病原菌污染的指示菌，为什么？
3.乳糖胆盐培养基是哪一类型的培养基？