体细胞无性系变异产生的来源和机理

从总体上讲，组织培养后植株变异的原因有三：一是由源植株中预先存在的变异的表达，二是组织培养过程中引起的可遗传的变异（DNA改变），三是由外遗传及生理作用引起。

（一）外植体中预先存在变异的表达

研究表明，某些体细胞无性系变异是由于外植体中细胞预先存在的变异的表达。一般说来，除非采用单细胞或原生质体，否则，对由不同类型细胞组成的多细胞外植体进行培养会导致再生植株表型的不一致性。预先存在变异包括内复制造成的细胞间染色体倍性差异，体细胞突变及DNA甲基化状态的变化等。由不定芽再生导致的嵌合体的分离（破坏、丢失或重排）是最明显的预先存在变异的表现。嵌合体一般可分为扇形嵌合体、部分周缘嵌合体和周缘嵌合体三种。前两种在常规繁殖中不稳定，而周缘嵌合体在常规繁殖中较为稳定，但即使是周缘嵌合体，利用组织培养进行快速繁殖或不定繁殖时，也会引起大部分嵌合体破坏（＞30%）。颜色、形态和生理习性嵌合体是可见的，而细胞嵌合体（染色体或染色体组不同的细胞）通常是难以直接观察到的，只对植株的营养价值、同工酶谱等表现有很小的影响。另一方面，由于病毒在植物体内不均匀分布，利用植物组织培养手段（分生组织培养、不定芽再生或原生质体培养等）可脱除植物病毒，从而也可引起性状的改变。

通常植物（指二倍体植物）的分生组织中都是二倍体细胞，所以采用顶端分生组织或幼嫩组织或器官作外植体进行启动培养，再生植株表型和倍性水平的稳定性远大于其他类型外植体培养获得的植株。

（二）培养中诱导产生的变异

培养中诱导产生的变异主要受培养类型（或植株再生方式）、外植体类型（或组织来源）、生长调节物质、培养物的年龄（或继代培养时间）、遗传组成（或基因型）等因素的影响。

1. 培养类型（或植株再生方式）

一般而言，一个已分化的细胞经历变化剧烈的脱分化和再分化很容易产生变异，因而愈伤组织培养常与体细胞无性系变异联系在一起；另一方面，愈伤组织通常从切口处产生，因而与活体中的伤口反应极为类似，容易激发转座子的活动，以及胁迫刺激诱导产生某种酶类或特异性附产物。因而商业微繁殖中尽量避免愈伤组织培养。体细胞无性系变异并不局限于愈伤组织培养，其它如直接不定芽发生和体细胞胚胎发生都可导致变异产生。

2. 外植体类型（或组织来源）

不同外植体类型产生的再生植株上的体细胞无性系变异频率和性质存在差异。一般而言，越衰老的、远离器官化分生组织生长程度高的或高度特化的组织进行培养，产生变异的机会越大，而幼龄的、预先存在分生组织或细胞的外植体（如顶芽、腋芽、分生组织）则很少发生，这是由于植物正常生长发育过程中常会伴随体细胞分化而使染色体组发生变化，如内多倍性、多线性、扩增或DNA序列的缩减等。但这并非绝对，例如从云杉胚性细胞系游离到的原生质体再生植株就没有产生变异。基于体细胞中染色体组变异程度，D’Amato（1985）将植物分为多体细胞（polysomatic）和非多体细胞（non-polysomatic）两种类型。在后一种植物类型中，已分化的体细胞与合子细胞的倍性水平一致，而前后一种植物类型则不同，会包含多倍性、甚至非整倍体细胞等。这种划分虽有理论上的意义，但在实际组织培养中很难区分，例如在Solanum brevidens组织培养中，从子叶再生的70%的植株为四倍体，而从叶片片段中再生的仅有20%为四倍体；而菊科植物花瓣再生的植株比花梗再生的植株更为多花，异常频率也更高；芳香的天竺葵植物从茎干再生植株的表型与对照无差异，而从根和叶柄再生的植株在形态上更易产生变异；马铃薯悬浮培养原生质体再生植株产生的变异要比叶肉原生质体再生植株产生的变异多。

3. 生长调节物质

生长调节物质的种类和浓度影响体细胞无性系变异的发生。生长调节物质可能起一种诱变剂的作用，但更多的证据表明其作用是通过细胞分裂、非器官化生长程度及特异细胞类型的优先增殖实现的。研究表明，生长调节物质可以影响DNA生物化学及有丝分裂器（纺缍丝）的功能，以及产生体外培养环境的选择压，并进一步引起有丝分裂异步。

组织培养中常用的几种调节物质都对DNA合成与多倍化有作用。2,4,5-T可在活体上诱导产生多倍体，2,4-D也可刺激DNA合成并引起内复制。内复制不稳定，容易发生核碎裂。2,4-D还可降低有丝分裂指数，并增加有丝分裂交

换。Kallak和Vapper（1985）表明2,4-D和激动素会引起染色体数目和结构变异，其它作者也报道2,4-D和BA可能会诱导产生变异。2,4-D可增加紫露草属植物雄蕊由蓝红向粉红的突变频率，还可显著增加Allium sativum根尖细胞中娣妹染色体交换频率。2,4-D通常可促进细胞生长和降低细胞周期所需的时间。另有证据表明，即便不经愈伤组织培养，生长调节物质的异常浓度也会引起体细胞无性系变异，例如在Kalanchoe blossfeldiana营养繁殖中芽原基的异常可归因于2,4-D的作用。因此，通常认为使用2,4-D会增加多倍体的产生与其它类型变异的发生，因此微繁殖中尽可能少用或不用2,4-D。

细胞分裂素对细胞分裂有活性，可以减少生长素引起的变异。在一些不定再生植株的例子中，等摩尔生长素和细胞分裂素发生变异的频率最低，但并非总是如此。激动素可减少秋水仙素处理植株中多倍体产生的比例，也可延缓原生质体多倍化的开始。在油棕及非洲大蕉微繁殖中，过量使用细胞分裂素会引起芽原基异常。总之，使用非平衡浓度的生长调节物质会引起再生植株的表型变异。

组织培养的另一个诱变作用可能是由于缺乏DNA快速合成所需充足的核酸前体物。腺嘌呤在植物组织培养（尤其是小组织、细胞或原生质体培养）中较常使用，但不清楚它对DNA合成与体外诱变之间的作用。

组织培养过程中会在培养容器中累积乙烯，乙烯在极低浓度（<0.01 ppm/V）下就可引起试管苗生长的严重异常。GA对微管有稳定作用，可以防止冷击和秋水仙素处理的有害影响，而乙烯会使微管不稳定。GA可极大地促进茶秋水仙素处理后Ribes植物的生长，而这会引起多倍体的产生。

在培养基中加入抗生素进行抑菌或检测转化细胞，或加入DNA合成有作用的其它化合物（如DNA合成抑制剂或诱变剂）也会诱导产生变异。

4. 培养物的年龄（或继代培养时间）

一般地，从衰老的培养物上再生的植株会产生更多的变异，或者说，变异程度随离体培养时间和继代次数的增加而增加，例如愈伤组织培养时间增加会提高细胞遗传（染色体数目和结构）异常。因而微繁殖企业要定期采集外植体以更新培养物。如香蕉微繁殖中每年都要从正常健壮母株上重新采集外植体，而且继代次数一般不超过8~10代。但在低温条件（如液氮温度）下则可对种质进行长期保存，而不会产生变异。

5. 遗传组成（或基因型）

有证据表明体细胞无性系变异是基因型依赖性的。无论其再生模式如何，基因型都影响体细胞无性系变异的发生，因为同一物种的不同品种产生的体细胞无性系变异的数量是不同的。Hwang和Ko（1986）报道在香蕉培养中总体变异率为3%，但“Cavedish”香蕉则高达20%。

源植株的倍性是一个重要因素，多倍体和染色体数目较大的物种其变异频率比二倍体和单倍体高。因为多倍体染色体组可缓冲染色体数目变异（如非整倍体）引起的不平衡，同时基因突变在多倍体中更易成活，尽管在单倍体和二倍体中更易表达。在对二倍体、四倍体和六倍体小麦细胞悬浮培养的比较后，发现二倍体最稳定，而六倍体最不稳定，在同一倍性水平内，不同基因型之间差异明显。大麦的体细胞无性系变异最少而裸麦则变异广泛。这种差异可能与其繁殖行为（大麦自交而裸麦异交）或DNA序列差异有关。在6个不同基因型的裸麦中，其中有4个为自交品种，另外2个为异交品种。在2个异交品种中，其中栽培品种“Ailés”发生高频率的自发转座，而另外一个则包含数目不同的B染色体。体细胞无性系在所有品系中都可发生，但在异交品系中最为普遍。其它因素如染色体组中异染色质所占的比重和可转位因子的携带与否都影响到体细胞无性系变异的发生。尽管异染色质的延迟复制特性会打乱细胞周期并促使离体培养细胞在分裂时染色体折断，但实际情况却是异染色质少的品种变异频率更高。许多作者报道组织培养可改变转座子的活性，而且组织培养可激活先前未有任何转座子活性记载的转座子。